Fasciola giganticaの排泄分泌産物（FgESPs）は、DNMT1とTET1が関与するメカニズムを介して、水牛樹状細胞の分化と免疫機能を調節する

Fasciola gigantica excretory-secretory products (FgESPs) modulate the differentiation and immune functions of buffalo dendritic cells through a mechanism involving DNMT1 and TET1.

• Xuefang Mei
• Wei Shi
• Wenping Zhao
• Honglin Luo
• Yaoyao Zhang
• Yurui Wang
• Zhaoan Sheng
• Dongying Wang
• Xing-Quan Zhu
• Weiyi Huang

抄録

背景:

Fasciola giganticaの感染は、世界中のヒトと動物の健康を脅かしている。このフリュークの排泄物／分泌物（ESPs）は、免疫細胞の活性化と成熟に障害を与えることが報告されている。我々はこれまでに、F. giganticaのESPs（FgESPs）が水牛樹状細胞（DC）の成熟に及ぼす影響を示してきた。しかし、その根底にあるメカニズムは明らかにされていませんでした。本研究の目的は、水牛樹状細胞（DC）の分化と免疫機能のシフトにおけるFgESPsの効力を調べることであった。

BACKGROUND: Fasciola gigantica infection threatens the health of both humans and animals in the world. The excretory/secretory products (ESPs) of this fluke has been reported to impair the activation and maturation of immune cells. We have previously shown the influence of F. gigantica ESPs (FgESPs) on the maturation of buffalo dendritic cells (DCs). However, the underlying mechanisms remain unclear. The objective of this study was to investigate the potency of FgESPs in shifting the differentiation and immune functions of buffalo DCs.

方法:

バッファローDCを直接FgESPsとインキュベートしたか、あるいはリンパ球との共培養を行った。DC の表現型、アポトーシスおよびメチル化を決定するために、Hoechst および Giemsa 染色アッセイ、透過型電子顕微鏡、カスパーゼ 3/7 活性試験およびヒストンメチル化試験を行った。DNAメチル化に関与するメカニズムを調べるために、水牛DCにおいてFgESPsとDNMT1/TET1との間に直接的な相互作用があるかどうかを調べるためにCo-IPアッセイと免疫蛍光染色アッセイを行い、DNMT1とTET1をノックダウンするためにRNAi技術を用いて、これらの遺伝子が存在しない場合のDCに対するFgESPsの影響を評価した。

METHODS: Buffalo DCs were incubated with FgESPs directly or further co-cultured with lymphocytes in vitro. qRT-PCR was employed to determine the gene expression profile of DCs or the mixed cells, and an ELISA was used to measure cytokine levels in the supernatants. Hoechst and Giemsa staining assays, transmission electron microscopy, caspase-3/7 activity test and histone methylation test were performed to determine DC phenotyping, apoptosis and methylation. To investigate the mechanism involved with DNA methylation, a Co-IP assay and immunofluorescent staining assay were performed to observe if there was any direct interaction between FgESPs and DNMT1/TET1 in buffalo DCs, while RNAi technology was employed to knockdown DNMT1 and TET1 in order to evaluate any different influence of FgESPs on DCs when these genes were absent.

結果:

qRT-PCRとELISAのデータは、DC単独と混合リンパ球反応（MLR）を持つDCにおいて、DC2とTh2/Tregマーカーのアップレギュレーションを示し、DC2の偏りがin vitroでTh2分化を誘導する可能性を示唆していた。また、DCのアポトーシスが発見され、形態学的および生化学的に証明されたことから、Treg分化を誘導した耐性化DCの供給源である可能性があることが示唆された。さらに、FgESPsはDNAメチル化と相関するヒストンH3K4とH3K9のメチル化レベルの変化を誘導した。Co-IP法と免疫蛍光による細胞内局在化アッセイでは、水牛DCにおいてFgESPsとDNMT1/TET1との間に直接的な相互作用は認められなかった。IL-6とIL-12の産生は、DNMT1とTET1のノックダウンによって変化することが明らかになった。

RESULTS: qRT-PCR and ELISA data together demonstrated the upregulation of DC2 and Th2/Treg markers in DCs alone and DCs with a mixed lymphocyte reaction (MLR), suggesting a bias of DC2 that potentially directed Th2 differentiation in vitro. DC apoptosis was also found and evidenced morphologically and biochemically, which might be a source of tolerogenic DCs that led to Treg differentiation. In addition, FgESPs induced methylation level changes of histones H3K4 and H3K9, which correlate with DNA methylation. Co-IP and immunofluorescent subcellular localization assays showed no direct interaction between the FgESPs and DNMT1/TET1 in buffalo DCs. The productions of IL-6 and IL-12 were found separately altered by the knockdown of DNMT1 and TET1 in DCs after FgESPs treatment.

結論:

FgESPsは、おそらくDNMT1またはTET1依存の方法（s）を介して、T細胞の下流のTh2/Treg応答を誘導するために、DC2表現型または水牛DCのアポトーシスを誘導する可能性があります。

CONCLUSIONS: FgESPs may induce the DC2 phenotype or the apoptosis of buffalo DCs to induce the downstream Th2/Treg response of T cells, possibly through a DNMT1- or TET1-dependent manner(s).