鉛に起因するマウス腎細胞におけるセレン含有タンパク質-グルタチオンペルオキシダーゼ3の不活性化に関するin vivoおよびin vitroでの研究

In vivo and in vitro studies on inactivation of selenium containing protein- glutathione peroxidase 3 in mice nephrocytes caused by lead.

• Hao Zhang
• Lingyu Luan
• Mengjiao Bi
• Lining Zhao
• Lin Yuan
• Jia Feng
• Rutao Liu

抄録

グルタチオンペルオキシダーゼ（Gpxs）は、鉛などの重金属による酸化ストレスから身を守るために、還元されたグルタチオンを触媒してヒドロペルオキシドなどの活性酸素を除去する重要な役割を担っています。Gpxsファミリーの中で、Gpx3は腎臓で合成され、血漿中に活発に分泌される唯一の細胞外酵素である。本研究では、鉛によるGPx3の不活性化のメカニズムを動物レベルと分子レベルの両面から検討した。6週齢のマウスを4群に無作為に分け、飲料水中の鉛濃度（0, 1, 2, 4g/L）を変えて4週間曝露した。血清中のGPx3の含有量を酵素免疫吸着法(ELISA)で、マウス腎細胞中のGpx3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCR(qPCR)で測定したところ、いずれも鉛濃度が高くなるとGpx3の活性が有意に阻害され、腎細胞中のマロンジアルデヒド(MDA)レベルが上昇することから、鉛がGpx3の機能に影響を与えて強い酸化ストレスを誘発することが示唆された。そこで、私たちはさらに、多重分光法、等温滴定熱量測定法(ITC)、分子ドッキング法を用いて、鉛によるGPx3不活性化の分子機構をin vitroで調べた。その結果、鉛はGPx3の構造ドメインに3:1の割合で強く結合し、高い結合親和性(K=3.1(±0.087)×10mol)でGPx3の蛍光を静態的に消光することがわかった。さらに、紫外可視分光法と円二色性分光法を用いてGPx3の構造を調べたところ、鉛はGPx3の骨格を緩め、トリプトファン残基周辺の疎水性を低下させることで、GPx3の二次構造を変化させることがわかった。本研究は、鉛がGPx3と相互作用してマウス腎細胞の酸化ストレスを誘導することをin vivo及びin vitro実験で証明した。

Glutathione peroxidases (Gpxs) play vital roles in elimination of hydroperoxide and other reactive oxygen species through catalyzing reduced glutathione to protect from oxidative stress caused by heavy metals such as lead. Among the family of Gpxs, Gpx3 is the only extracellular enzyme synthesized in the kidney and actively secreted into the plasma. This study investigated mechanisms of lead-induced GPx3 inactivation both at the animal and molecular levels. Six-week-old mice were randomly divided into 4 groups, and exposed to different lead concentrations (0, 1, 2 and 4 g/L) in their drinking water for 4 weeks. Contents of GPx3 in blood serum were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the mRNA levels of Gpx3 in mice nephrocytes were determined by quantitative real-time PCR (qPCR), both of which showed significantly inhibited at higher lead concentrations accompanied by the decreased Gpx3 activities and the elevated levels of malondialdehyde (MDA) in nephrocytes, which indicated that lead could induce strongly oxidative stress through affecting Gpx3 function. So we further investigated molecular mechanisms of GPx3 inactivation caused by lead with multiple spectroscopic techniques, isothermal titration calorimetry (ITC) and molecular docking studies in vitro. Results showed that lead statically quenched GPx3 fluorescence by tightly binding to the structural domain of GPx3 in a 3:1 ratio with high binding affinity (K = 3.1(±0.087) × 10 mol). Further investigation of the conformation of GPx3 by UV-visible spectroscopy and circular dichroism (CD) spectroscopy indicated that lead changed the secondary structure of GPx3 by loosening the GPx3 skeleton and decreasing the hydrophobicity around tryptophan residues. This work proved in vivo and in vitro experiments that lead could induce oxidative stress in mice nephrocytes by interacting with GPx3.

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