適応的実験室進化により選抜されたKluyveromyces marxianus CCT 7735のエタノール耐性の評価

Assessment of ethanol tolerance of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 selected by adaptive laboratory evolution.

• Fernando Augusto da Silveira
• Dalila Luzia de Oliveira Soares
• Kyung Whan Bang
• Thércia Rocha Balbino
• Maurício Alexander de Moura Ferreira
• Raphael Hermano Santos Diniz
• Lorena Azevedo de Lima
• Marcelo Mendes Brandão
• Silas Granato Villas-Bôas
• Wendel Batista da Silveira

抄録

Kluyveromyces marxianus CCT 7735 は乳糖からエタノールを生産する可能性を示しているが、そのエタノール耐性の低さが工業的応用の欠点となっている。本研究の第一の目的は、実験室での適応的進化により、エタノール耐性を有する4つのKluyveromyces marxianus CCT 7735株（ETS1, ETS2, ETS3, ETS4）を得ることであった。第二の目的は、これらの中から顕著な株を選択し、この株のエタノール耐性向上に伴う代謝変化を評価することであった。ETS4 は、エタノールストレス下で親株よりも高い比成長率（122％）と非ストレス下での比エタノール生産率（0.26g/g/h）が ETS1（0.22g/g/h）、ETS2（0.17g/g/h）、ETS3（0.17g/g/h）よりも高いことから選抜した。さらに、代謝変化の特徴を明らかにするために、ETS4を親株と比較して解析を行った。バリンとクエン酸サイクルの代謝物（イソクエン酸、クエン酸、シス-アコニ ン酸）の蓄積はエタノールストレス下のETS4のみで観察された。これらの蓄積がエタノール耐性を高めるために重要であったと考えられる。さらに、脂肪酸メチルエステルとエルゴステロールの含有量は、親株に比べて ETS4 の方が高かった。これらの違いがエタノール耐性の向上に寄与していると考えられる。本研究では、エタノール耐性を有する K. marxianus 株を実験室での適応進化により選抜した。 ETS4 では、バリンや TCA サイクルの代謝物が蓄積されていた。

Kluyveromyces marxianus CCT 7735 shows potential for producing ethanol from lactose; however, its low ethanol tolerance is a drawback for its industrial application. The first aim of this study was to obtain four ethanol-tolerant K. marxianus CCT 7735 strains (ETS1, ETS2, ETS3, and ETS4) by adaptive laboratory evolution. The second aim was to select among them the strain that stood out and to evaluate metabolic changes associated with the improved ethanol tolerance in this strain. The ETS4 was selected for displaying a specific growth rate higher than the parental strain under ethanol stress (122%) and specific ethanol production rate (0.26 g/g/h) higher than those presented by the ETS1 (0.22 g/g/h), ETS2 (0.17 g/g/h), and ETS3 (0.17 g/g/h) under non-stress condition. Further analyses were performed with the ETS4 in comparison with its parental strain in order to characterize metabolic changes. Accumulation of valine and metabolites of the citric acid cycle (isocitric acid, citric acid, and cis-aconitic acid) was observed only in the ETS4 subjected to ethanol stress. Their accumulation in this strain may have been important to increase ethanol tolerance. Furthermore, the contents of fatty acid methyl esters and ergosterol were higher in the ETS4 than in the parental strain. These differences likely contributed to enhance ethanol tolerance in the ETS4. KEY POINTS: • K. marxianus ethanol-tolerant strains were selected by adaptive laboratory evolution. • Valine and metabolites of the TCA cycle were accumulated in the ETS4. • High contents of fatty acids and ergosterol contributed to enhance ethanol tolerance.