フローサイトメトリーを用いた細菌群集動態の定量化のためのグラムおよびバイアビリティー染色法の評価

Assessment of Gram- and Viability-Staining Methods for Quantifying Bacterial Community Dynamics Using Flow Cytometry.

• Aurore Duquenoy
• Samuel Bellais
• Cyrielle Gasc
• Carole Schwintner
• Joël Dore
• Vincent Thomas

抄録

過去数年の間に、腸内細菌叢が多くのヒト疾患との関連性を示唆する報告が増加していることから、腸内細菌叢は主要な関心分野となっています。このような状況の中で、これらの複雑な生態系を簡単かつ費用対効果の高い方法で解析し、経時的な変化を追跡するための解析ツールの開発が大きな関心を集めています。微生物生態系の特徴付けには、配列ベースのメタゲノミクスプロファイリングが広く利用されているが、解析には時間と専門的な知識が必要である。フローサイトメトリーはこれらの欠点を克服し、数時間以内にコミュニティに関する重要な情報を提供する。さらに、フローサイトメトリーは、興味のある特定の細菌を選択、単離、培養するために使用できる可能性がある。この研究では、古典的なLive/Dead染色で染色し、嫌気性条件下でフローサイトメトリーを用いて選別した厳密に嫌気性の細菌の培養性を評価した。この「生存可能な」画分の選別により、厳密嫌気性細菌の純培養物の同定された「生存可能な」細胞の１０〜８０％が培養可能であることが示された。さらに、複雑な生態系においてグラム陽性菌とグラム陰性菌を識別するために、標識バンコマイシンと小麦胚芽アグルチニン（WGA）レクチンの組み合わせを使用することを試験した。好気性/嫌気性切片性細菌と厳格な嫌気性細菌の両方で検証した後、染色法を複雑な生態系に適用し、培養条件の違いを明らかにし、わずかなpHの変化が微生物群集構造に強い影響を与えることを実証した（16S rRNA遺伝子配列決定により確認）。このような染色法を組み合わせることで、複雑な微生物群集の進化を追跡することが可能となり、将来的には様々な用途での迅速な解析ツールとしての利用が期待されています。今回開発したフローサイトメトリー染色法は、細菌群集の動態の変化を浮き彫りにすることで、複雑な生態系の解析を容易にする可能性を秘めています。これは、研究および産業界の両方の文脈において、広範囲の生態系または既知の細菌種のコミュニティにリンクされたプロセスの制御を改善するための効率的かつ迅速なアプローチとして適用可能であることが想定されます。

Over the past years, gut microbiota became a major field of interest with increasing reports suggesting its association with a large number of human diseases. In this context, there is a major interest to develop analysis tools allowing simple and cost-effective population pattern analysis of these complex ecosystems to follow changes over time. Whereas sequence-based metagenomics profiling is widely used for microbial ecosystems characterization, it still requires time and specific expertise for analysis. Flow cytometry overcomes these disadvantages, providing key information on communities within hours. In addition, it can potentially be used to select, isolate and cultivate specific bacteria of interest. In this study, we evaluated the culturability of strictly anaerobic bacteria that were stained with a classical Live/Dead staining, and then sorted using flow cytometry under anaerobic conditions. This sorting of "viable" fraction demonstrated that 10-80% of identified "viable" cells of pure cultures of strictly anaerobic bacteria were culturable. In addition, we tested the use of a combination of labeled vancomycin and Wheat Germ Agglutinin (WGA) lectin to discriminate Gram-positive from Gram-negative bacteria in complex ecosystems. After validation on both aerobic/anaerobic facultative and strictly anaerobic bacteria, the staining methods were applied on complex ecosystems, revealing differences between culture conditions and demonstrating that minor pH variations have strong impacts on microbial community structure, which was confirmed by 16S rRNA gene sequencing. This combination of staining methods makes it possible to follow-up evolutions of complex microbial communities, supporting its future use as a rapid analysis tool in various applications. The flow cytometry staining method that was developed has the potential to facilitate the analysis of complex ecosystems by highlighting changes in bacterial communities' dynamics. It is assumed to be applicable as an efficient and fast approach to improve the control of processes linked to a wide range of ecosystems or known communities of bacterial species in both research and industrial contexts.

Copyright © 2020 Duquenoy, Bellais, Gasc, Schwintner, Dore and Thomas.