生体内での全生物学的アプローチを用いたヘルミン目細胞外小胞の蛍光標識

Fluorescent Labeling of Helminth Extracellular Vesicles Using an In Vivo Whole Organism Approach.

• Anders T Boysen
• Bradley Whitehead
• Allan Stensballe
• Anna Carnerup
• Tommy Nylander
• Peter Nejsum

抄録

過去20年の間に、古細菌、細菌、真核生物の3つの生命領域の細胞外小胞（EV）が科学的に注目されるようになってきました。そのため、宿主と病原体とのコミュニケーションや免疫調節におけるEVの役割についての研究が盛んに行われています。EV研究で重要なのは、EVが生体内でどのように、どこでレシピエント細胞や臓器に取り込まれるかを決定することであり、ラベル付けを含む適切な追跡戦略が必要です。EVのラベル付けは、非特異的なラベル付けやラベル付けのアーティファクトの導入のリスクを高めるアイソレーション後に行われることが多い。ここで我々は、蛍光脂質アナログの全生物の取り込みとEVでの後続の組み込みによってEVのラベル付けを可能にするために、de novo脂肪酸を合成するためにヘルメットの能力を開発しました。我々は、1,2-ジオロイロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノラミン-N-(リサミン-ロダミン-B-スルホニル) (DOPE-Rho)の取り込みを個体と幼虫で確認した。DOPE-Rhoで標識したSpp.の上清から分離したEVは、EVのサイズ、構造および蛍光に対する標識の効果を評価するために特徴づけられた。蛍光性EVは、ヒトマクロファージ細胞株THP-1に取り込まれることに成功した。したがって、本研究は、寄生虫学の分野で、また複数の種にまたがる可能性のあるEVの分野で利用可能な新しい染色法を提示するものである。

In the last two decades, extracellular vesicles (EVs) from the three domains of life, Archaea, Bacteria and Eukaryotes, have gained increasing scientific attention. As such, the role of EVs in host-pathogen communication and immune modulation are being intensely investigated. Pivotal to EV research is the determination of how and where EVs are taken up by recipient cells and organs in vivo, which requires suitable tracking strategies including labelling. Labelling of EVs is often performed post-isolation which increases risks of non-specific labelling and the introduction of labelling artefacts. Here we exploited the inability of helminths to de novo synthesise fatty acids to enable labelling of EVs by whole organism uptake of fluorescent lipid analogues and the subsequent incorporation in EVs. We showed uptake of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (DOPE-Rho) in spp. and larvae. EVs isolated from the supernatant of spp. labelled with DOPE-Rho were characterised to assess the effects of labelling on size, structure and fluorescence of EVs. Fluorescent EVs were successfully taken up by the human macrophage cell line THP-1. This study, therefore, presents a novel staining method that can be utilized by the EV field in parasitology and potentially across multiple species.