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DNA メチル化バイオマーカーの分析を介した大腸がん検診のための便 DNA 前処理プロトコルの系統的評価
A systematic evaluation of stool DNA preparation protocols for colorectal cancer screening via analysis of DNA methylation biomarkers.
PMID: 32673280 DOI: 10.1515/cclm-2020-0300.
抄録
目的 便サンプルを用いた大腸がん（CRC）スクリーニングは現在、NDRG4やSDC2などの主要なマーカーのための腫瘍DNAメチル化分析が検査の不可欠な一部となっており、日常的に使用されている。しかし、ヒトゲノムDNAを再現性よく効率的に抽出するために便サンプルを処理することは、より優れたバイオマーカーやアッセイの研究を進める上でのボトルネックとなっている。方法 我々は、便サンプルの処理と DNA 抽出に関与するいくつかの要因を系統的に評価した。これらの要因には、便の処理（固体およびホモジナイズされたサンプル）、上清およびペレットからの DNA の調製、およびカラムおよび磁気ビーズをベースとした方法による DNA 抽出が含まれる。さらに、SDC2およびNDRG4のメチル化レベルを用いて、最適なプロトコールの臨床性能を評価した。結果 全ゲノムDNAおよびヒトゲノムDNA（hgDNA）の収量は、サンプリングのばらつきのためか、固形便掻き取り法を用いた場合には再現性がなかった。より再現性の高い結果は、均質化された便サンプルから得られた。均質化された便からの上清を使用した磁気ビーズベースのDNA抽出は、より良い再現性、より高いhgDNA収量、低い非hgDNAバックグラウンド、および自動化の可能性のために、さらなる分析のために選択されました。このプロトコルでは、線形回帰モデルを用いた SDC2 と NDRG4 のメチル化シグナルの組み合わせにより、感度 81.82%と特異度 93.75%を達成した。結論 異なる便処理法と DNA 抽出法を系統的に評価することで、大腸がん検診のための便サンプル中の腫瘍 DNA メチル化マーカーを分析するための再現性のあるプロトコールを確立した。
Objectives Colorectal cancer (CRC) screening using stool samples is now in routine use where tumor DNA methylation analysis for leading markers such as NDRG4 and SDC2 is an integral part of the test. However, processing stool samples for reproducible and efficient extraction of human genomic DNA remains a bottleneck for further research into better biomarkers and assays. Methods We systematically evaluated several factors involved in the processing of stool samples and extraction of DNA. These factors include: stool processing (solid and homogenized samples), preparation of DNA from supernatant and pellets, and DNA extraction with column and magnetic beads-based methods. Furthermore, SDC2 and NDRG4 methylation levels were used to evaluate the clinical performance of the optimal protocol. Results The yield of total and human genomic DNA (hgDNA) was not reproducible when solid stool scraping is used, possibly due to sampling variations. More reproducible results were obtained from homogenized stool samples. Magnetic beads-based DNA extraction using the supernatant from the homogenized stool was chosen for further analysis due to better reproducibility, higher hgDNA yield, lower non-hgDNA background, and the potential for automation. With this protocol, a combination of SDC2 and NDRG4 methylation signals with a linear regression model achieved a sensitivity and specificity of 81.82 and 93.75%, respectively. Conclusions Through the systematic evaluation of different stool processing and DNA extraction methods, we established a reproducible protocol for analyzing tumor DNA methylation markers in stool samples for colorectal cancer screening.