骨組織工学のための3Dバイオミメティック足場における歯由来幹細胞の挙動を明らかにした

Clarifying the Tooth-Derived Stem Cells Behavior in a 3D Biomimetic Scaffold for Bone Tissue Engineering Applications.

• Christiane L Salgado
• Cristina C Barrias
• Fernando J M Monteiro

抄録

組織工学的な3D構築物を作製するためには大量の細胞が必要であり、そのためには、栄養分や酸素の拡散を促進するために、動的条件下での足場上での培養が必要となります。動的培養は、静的条件と比較して、細胞の生存率および増殖率を向上させることが期待される。しかし、異なるタイプの細胞および／または組織由来の細胞は、外部刺激に対して異なる反応を示し、機械的なせん断応力下での培養とは相容れない場合がある。本研究の最初の目的は、歯科用幹細胞が人工移植片の骨再生能を向上させるための貴重な供給源であることを示すことであった。間葉系幹細胞/幹細胞（MSC）をヒトの歯科用卵胞（hDFMSC）および歯髄組織（hDPMSC）から分離し、プロトタイプの幹細胞マーカーを発現することを示した。骨芽細胞系への分化能力を評価するために、コラーゲン-ナノハイドロキシアパタイト/ホスホセリンバイオコンポジットクライオゲルの3次元多孔質足場上に、培養液中に骨形成因子を添加して播種した後、歯根由来と歯髄由来のMSCsの能力を評価した。その結果、いずれの歯由来のMSCも高いALP活性を示し、骨形成遺伝子マーカーを発現し、オステオポンチン(OPN)を分泌することが確認された。その後、スピナーフラスコに適合するように設計されたマルチコンパートメントホルダーを用いて、多孔質3D足場内での両タイプの歯由来MSCの動的培養(50rpm)を行った。コントロールとして標準的な静的培養条件を用いた。動的条件下での培養は、足場内の空間分布を改善しながら、卵胞MSCの増殖を促進した。動的条件下での培養では、アルカリホスファターゼ（ALP）活性の増加、骨形成遺伝子の発現の増加、OPNの沈着によって示唆されるように、バイオコンポジット足場はMSCの骨形成分化を促進した。同様に、動的条件下では、静的条件下と比較して、歯髄MSCも高いALP活性と増殖率を示したが、オステオポンチンの分泌量は低かった。移植後、動的条件下で培養した歯根MSCを負荷した3D足場は、歯髄細胞よりも高い組織成長と骨形成分化（ヒトOPN分泌量の増加）を示した。本研究では、歯由来の幹細胞を骨組織工学の臨床的な代替源として利用することと、細胞を搭載した3D足場の動的培養のための革新的な装置の開発を検討した。その結果、3D足場上で培養した際のヒトMSCの反応は、細胞供給源と培養レジメンに依存することが示された。このことは、最終的な臨床応用に応じて、細胞の種類と培養条件の両方を慎重に調整する必要があることを示唆している。

Massive amounts of cell are needed for creating tissue engineered 3D constructs, which often requires culture on scaffolds under dynamic conditions to facilitate nutrients and oxygen diffusion. Dynamic cultures are expected to improve cell viability and proliferation rate, when compared to static conditions. However, cells from distinct types and/or tissues sources may respond differently to external stimuli and be incompatible with culture under mechanical shear stress. The first aim of this work was to show that dental stem cells are a valuable source for improving bone regeneration potential of artificial grafts. Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) were isolated from human dental follicle (hDFMSC) and pulp tissues (hDPMSC) and shown to express prototypical stem cell markers. The follicle and pulp dental MSCs capacity to differentiate into osteoblast lineage was evaluated after seeding on 3D porous scaffolds of collagen-nanohydroxyapatite/phosphoserine biocomposite cryogel with osteogenic factors in the culture medium. Both tooth-derived MSCs were able to show high ALP activity, express osteogenic gene markers and secrete osteopontin (OPN). Thereafter, designed multicompartment holder adaptable to spinner flasks was used for dynamic culture (50 rpm) of both dental MSCs types within the porous 3D scaffolds. Standard static culture conditions were used as control. Culture under dynamic conditions promoted follicle MSCs proliferation, while improving their spatial distribution within the scaffold. Under dynamic conditions, the biocomposite scaffold promoted MSCs osteogenic differentiation, as suggested by increased alkaline phosphatase (ALP) activity, higher osteogenic gene expression and OPN deposition. In a similar manner, under dynamic conditions, dental pulp MSCs also showed higher ALP activity and proliferation rate, but lower amounts of osteopontin secretion, when compared to static conditions. After implantation, dental follicle MSCs-loaded 3D scaffolds cultured under dynamic conditions showed higher tissue ingrowth and osteogenic differentiation (higher human OPN secretion) than dental pulp cells. Overall, this study explored the use of tooth-derived stem cells as a clinical alternative source for bone tissue engineering, together with an innovative device for dynamic culture of cell-laden 3D scaffolds. Results showed that human MSCs response upon culture on 3D scaffolds, depends on the cells source and the culture regimen. This suggests that both the type of cells and their culture conditions should be carefully adjusted according to the final clinical application.

Copyright © 2020 Salgado, Barrias and Monteiro.