T4ファージ足場上でのマルチエンザイムアセンブリ

Multi-Enzyme Assembly on T4 Phage Scaffold.

• Jinny L Liu
• Daniel Zabetakis
• Joyce C Breger
• George P Anderson
• Ellen R Goldman

抄録

過去20年以上にわたり、基質チャネリングと強化された安定性の概念に基づいて、酵素活性を高めるために、酵素カスケードを空間的に整理するための様々な足場が設計され、合成されてきました。酵素固定化のために知られている最も生体適合性の高い合成足場は、タンパク質やDNAナノ構造体である。ここでは、3つの酵素カスケードを固定化するための天然由来のタンパク質足場として、T4ファージのキャプシドの有用性を検討した。アミラーゼ、マルターゼ、グルコキナーゼの3つの酵素カスケードを固定化するための天然由来のタンパク質足場としての有用性を調べた。各酵素と外側のキャプシドタンパク質Hocの間の共有結合コンストラクトは、SpyTagとSpyCatcherのペアリングを介して調製され、ファージのキャプシド上にアセンブルされ、キャプシドあたりの推定平均90コピーである。カプシドに固定化されたマルターゼは、溶液中に遊離したマルターゼと比較して4倍高い初期速度を有する。また、速度論的分析により、固定化された3つの酵素カスケードは、溶液中の混合物と比較して18倍高いNADからNADHへの変換数を有することが明らかになった。我々の結果は、T4ファージのキャプシドが、キャプシドHoc上で酵素を空間的に組織化することにより、酵素活性を増強する実質的な可能性を有する天然に存在する足場として機能し得ることを示している。

Over the past two decades, various scaffolds have been designed and synthesized to organize enzyme cascades spatially for enhanced enzyme activity based on the concepts of substrate channeling and enhanced stability. The most bio-compatible synthetic scaffolds known for enzyme immobilization are protein and DNA nanostructures. Herein, we examined the utility of the T4 phage capsid to serve as a naturally occurring protein scaffold for the immobilization of a three-enzyme cascade: Amylase, Maltase, and Glucokinase. Covalent constructs between each of the enzymes and the outer capsid protein Hoc were prepared through SpyTag-SpyCatcher pairing and assembled onto phage capsids with an estimated average of 90 copies per capsid. The capsid-immobilized Maltase has a fourfold higher initial rate relative to Maltase free in solution. Kinetic analysis also revealed that the immobilized three-enzyme cascade has an 18-fold higher converted number of NAD to NADH relative to the mixtures in solution. Our results demonstrate that the T4 phage capsid can act as a naturally occurring scaffold with substantial potential to enhance enzyme activity by spatially organizing enzymes on the capsid Hoc.

Copyright © 2020 Liu, Zabetakis, Breger, Anderson and Goldman.