網膜の健康と変性における小・中細胞外ベシクルとそのmiRNAカーゴ。網膜の恒常性維持のメディエーター、標的遺伝子治療のためのビークル

Small-Medium Extracellular Vesicles and Their miRNA Cargo in Retinal Health and Degeneration: Mediators of Homeostasis, and Vehicles for Targeted Gene Therapy.

• Yvette Wooff
• Adrian V Cioanca
• Joshua A Chu-Tan
• Riemke Aggio-Bruce
• Ulrike Schumann
• Riccardo Natoli

抄録

加齢黄斑変性症（AMD）などの網膜変性疾患では、視細胞死や炎症が進行することが知られている。しかし、これらの生物学的過程を支える分子機構はほとんどわかっていません。細胞外小胞（EV）は、免疫応答の調節に新たな役割を果たす細胞間コミュニケーションの重要な媒介物質である。エクソソソームを含むEVは、マイクロRNA（miRNA）をカプセル化してレシピエント細胞に転送し、この方法でレシピエント細胞の環境を調節することができます。しかし、EVの制御異常は、細胞の恒常性の喪失や炎症の増加と関連している。本研究では、エクソソームを含む単離された網膜小・中型EV（s-mEV）の役割を、健常網膜と変性網膜の両方で調べました。正常網膜から単離された s-mEV を動的光散乱、透過型電子顕微鏡、ウエスタンブロッティングを用いて特徴付け、ナノトラッキング分析を用いて光酸化ダメージ誘発性変性の 5 日間にわたって定量した。また、健康な網膜と損傷を受けた網膜から分離された網膜s-mEVのmiRNAカーゴの特徴付けにsmall RNAseqを使用した。最後に、エキソソソーム阻害剤GW4869の全身日局投与と、s-mEVに多く含まれるmiRNAであるmiR-124-3pのハイブリダイゼーションを用いて、エキソソソーム阻害の細胞間miRNA移行および免疫調節への影響を調べた。また、GW4869誘発エキソソーム枯渇による網膜の機能的・形態的変化を評価するために、網膜電図検査と免疫組織化学検査を実施した。その結果、s-mEV濃度と視細胞の生存率との間には逆相関があり、変性後のs-mEV数は減少することが示された。また、small RNAseq解析の結果、s-mEVには網膜組織全体と比較してmiRNAが特異的に濃縮されていることが明らかになったが、光酸化損傷後のs-mEVのmiRNAnomeには差が見られなかった。また、GW4869 によるエクソソーム阻害は網膜変性を悪化させ、エクソソーム阻害マウスでは光酸化損傷後に網膜機能の低下や炎症・細胞死レベルの上昇が認められた。さらに、GW4869投与マウスでは、光受容体由来のmiR-124-3pの網膜内への転座が障害されていた。以上のことから、網膜 s-mEV とその miRNA カーゴは、免疫制御による網膜の恒常性維持に重要な役割を果たしており、網膜変性疾患の標的遺伝子治療に利用できる可能性があることが示唆された。

Photoreceptor cell death and inflammation are known to occur progressively in retinal degenerative diseases such as age-related macular degeneration (AMD). However, the molecular mechanisms underlying these biological processes are largely unknown. Extracellular vesicles (EV) are essential mediators of cell-to-cell communication with emerging roles in the modulation of immune responses. EVs, including exosomes, encapsulate and transfer microRNA (miRNA) to recipient cells and in this way can modulate the environment of recipient cells. Dysregulation of EVs however is correlated to a loss of cellular homeostasis and increased inflammation. In this work we investigated the role of isolated retinal small-medium sized EV (s-mEV) which includes exosomes in both the healthy and degenerating retina. Isolated s-mEV from normal retinas were characterized using dynamic light scattering, transmission electron microscopy and western blotting, and quantified across 5 days of photo-oxidative damage-induced degeneration using nanotracking analysis. Small RNAseq was used to characterize the miRNA cargo of retinal s-mEV isolated from healthy and damaged retinas. Finally, the effect of exosome inhibition on cell-to-cell miRNA transfer and immune modulation was conducted using systemic daily administration of exosome inhibitor GW4869 and hybridization of s-mEV-abundant miRNA, miR-124-3p. Electroretinography and immunohistochemistry was performed to assess functional and morphological changes to the retina as a result of GW4869-induced exosome depletion. Results demonstrated an inverse correlation between s-mEV concentration and photoreceptor survivability, with a decrease in s-mEV numbers following degeneration. Small RNAseq revealed that s-mEVs contained uniquely enriched miRNAs in comparison to in whole retinal tissue, however, there was no differential change in the s-mEV miRNAnome following photo-oxidative damage. Exosome inhibition via the use of GW4869 was also found to exacerbate retinal degeneration, with reduced retinal function and increased levels of inflammation and cell death demonstrated following photo-oxidative damage in exosome-inhibited mice. Further, GW4869-treated mice displayed impaired translocation of photoreceptor-derived miR-124-3p to the inner retina during damage. Taken together, we propose that retinal s-mEV and their miRNA cargo play an essential role in maintaining retinal homeostasis through immune-modulation, and have the potential to be used in targeted gene therapy for retinal degenerative diseases.

Copyright © 2020 Wooff, Cioanca, Chu-Tan, Aggio-Bruce, Schumann and Natoli.