フレームシフト変異による遺伝子の不活化は、減衰したワクシニアウイルスの迅速な適応を提供する

Inactivation of genes by frameshift mutations provides rapid adaptation of an attenuated vaccinia virus.

• Tatiana G Senkevich
• Erik K Zhivkoplias
• Andrea S Weisberg
• Bernard Moss

抄録

RNAウイルスとは異なり、ほとんどのDNAウイルスは、塩基置換エラーを起こすことがほとんどない高忠実度ポリメラーゼを用いてゲノムを複製する。それにもかかわらず、実験的な進化研究により、減衰型ワクシニアウイルス（VACV）を連続的に通過させる間に、適応突然変異が急速に獲得されることが明らかになっている。適応変異が起こる方法の一つは、遺伝子コピー数の増加に続いて塩基置換が起こり、最後に遺伝子コピー数が収縮するというアコーディオン機構によるものである。ここでは、減衰したVACVの通過中に、遺伝子不活性化フレームシフト機構により、複数の適応変異が急速に獲得されることを示しています。減衰は、VACVのA8R中間転写因子遺伝子をミクソーマウイルスのオルソログと交換することで達成された。減衰したウイルスの3回の並行パッセージでは、6種類の遺伝子に合計7つの突然変異が発生した。最も頻度の高い突然変異は、5～7個のAsまたはTのラン内での1ヌクレオチド挿入または欠失であったが、11個のヌクレオチドの欠失も発生し、フレームシフトおよび早期停止コドンをもたらした。10回の通過ラウンドの間に、減衰したVACVを変異株に置き換えた。実験終了時には、実質的に残ったすべてのウイルスは、１個の固定変異と１個以上の追加変異を有していた。転写装置のヌクレオチド置換が2つの低頻度変異を占めたが、成熟したウイルスのタンパク質成分をコードする遺伝子、すなわちA26L、G6RおよびA14.5Lのフレームシフトは、74〜98％の固定化を達成した。この変異の適応的役割は、A26L、G6R、またはその両方を欠失させた組換えVACVを作製することで確認され、ウイルスの複製が増加し、粒子/プラーク形成単位比が低下することが示された。遺伝子の不活性化は、オルソポキシーウイルスの進化の重要なドライバーと考えられています。カウポックスウイルスは、各オルソウイルス種に存在する遺伝子の無傷のオルソログを含んでいるが、オルソウイルス属の他のすべてのメンバーでは、多数の遺伝子が不活化されている。追加の遺伝子の不活化は、細胞培養におけるオルソポキソウイルスの広範な継代に伴って起こり得るが、これはワクチンを作るための戦略である生体内での減衰につながる。複数のウイルス遺伝子の不活化が宿主細胞での複製を促進するのか、あるいは中立的な効果を持つのかは、ほとんどの場合不明である。減衰したワクシニアウイルスを連続的に継代する実験的進化プロトコルを用いて、不活性化フレームシフト変異の急速な獲得が起こった。わずか10回の継代の後、最初に導入された減衰型ワクシニアウイルスは、1つの固定突然変異と1つ以上の追加突然変異を持つウイルスによって置換された。実験的進化の間の複数の不活性化突然変異の頻度は、通常の進化とワクチン株を作るための広範なウイルス通過の間の不活性化突然変異の獲得をシミュレートしている。

Unlike RNA viruses, most DNA viruses replicate their genomes with high fidelity polymerases that rarely make base substitution errors. Nevertheless, experimental evolution studies reveal rapid acquisition of adaptive mutations during serial passage of attenuated vaccinia virus (VACV). One way adaptation can occur is by an accordion mechanism in which gene copy number increases followed by base substitutions and finally contraction of gene copy number. Here we show rapid acquisition of multiple adaptive mutations by a gene inactivating frameshift mechanism during passage of an attenuated VACV. Attenuation had been achieved by exchanging the VACV A8R intermediate transcription factor gene with the myxoma virus ortholog. A total of seven mutations in six different genes occurred in three parallel passages of the attenuated virus. The most frequent mutations were single nucleotide insertions or deletions within runs of five to seven As or Ts, although a deletion of 11 nucleotides also occurred, leading to frameshifts and premature stop codons. During ten passage rounds, the attenuated VACV was replaced by the mutated strains. At the end of the experiment, virtually all remaining viruses had one fixed mutation and one or more additional mutations. Although nucleotide substitutions in the transcription apparatus accounted for two low frequency mutations, frameshifts in genes encoding protein components of the mature virion, namely A26L, G6R and A14.5L, achieved 74 to 98% fixation. The adaptive role of the mutations was confirmed by making recombinant VACV with A26L, G6R or both deleted, which increased virus replication and decreased particle/plaque forming unit ratios. Gene inactivation is considered to be an important driver of orthopoxirus evolution. Whereas cowpox virus contains intact orthologs of genes present in each orthopoxvirus species, numerous genes are inactivated in all other members of the genus. Inactivation of additional genes can occur upon extensive passaging of orthopoxviruses in cell culture leading to attenuation in vivo, a strategy for making vaccines. Whether inactivation of multiple viral genes enhances replication in the host cells or has a neutral effect is unknown in most cases. Using an experimental evolution protocol involving serial passages of an attenuated vaccinia virus, rapid acquisition of inactivating frameshift mutations occurred. After only 10 passage rounds, the starting attenuated vaccinia virus was displaced by viruses with one fixed mutation and one or more additional mutations. The frequency of multiple inactivating mutations during experimental evolution simulates their acquisition during normal evolution and extensive virus passaging to make vaccine strains.

Copyright © 2020 American Society for Microbiology.