テロメアの代替長化（ALT）細胞におけるサブテロメアおよびテロメアの単分子解析

Single-molecule analysis of subtelomeres and telomeres in Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) cells.

• Heba Z Abid
• Jennifer McCaffrey
• Kaitlin Raseley
• Eleanor Young
• Katy Lassahn
• Dharma Varapula
• Harold Riethman
• Ming Xiao

抄録

背景:

テロメアDNAは典型的にはG-richタンデムリピートモチーフで構成され、テロメラーゼによって維持される(Greider CW, Blackburn EH; Cell 51:887-898; 1987)。テロメラーゼを欠く真核生物では、テロメア維持のための様々なDNA修復およびDNA組換えに基づく経路が、テロメア伸長のために通常テロメラーゼに依存する生物において進化してきた(Webb CJ, Wu Y, Zakian VA; Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a012666; 2013)；総称してテロメアのオルタナティブ伸長(ALT)経路と呼ばれる。光学的にマッピングされた同じ大きなDNA分子から（TTAGGG）nトラクト長を測定することにより、ALT陽性細胞株U2OS、SK-MEL-2およびSaos-2における多数の特定のサブテロメア遺伝子座におけるテロメア長ダイナミクスおよびサブテロメア結合構造変化を同時に解析した。

BACKGROUND: Telomeric DNA is typically comprised of G-rich tandem repeat motifs and maintained by telomerase (Greider CW, Blackburn EH; Cell 51:887-898; 1987). In eukaryotes lacking telomerase, a variety of DNA repair and DNA recombination based pathways for telomere maintenance have evolved in organisms normally dependent upon telomerase for telomere elongation (Webb CJ, Wu Y, Zakian VA; Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a012666; 2013); collectively called Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) pathways. By measuring (TTAGGG) n tract lengths from the same large DNA molecules that were optically mapped, we simultaneously analyzed telomere length dynamics and subtelomere-linked structural changes at a large number of specific subtelomeric loci in the ALT-positive cell lines U2OS, SK-MEL-2 and Saos-2.

結果:

私たちの結果は、遺伝子座特異的なALTテロメアの特徴を明らかにしました。例えば、各サブテロメアは、末端（ＴＴＡＧＧＧＧ）ｎトラクトを有する単一分子の例および組換えテロメア単一分子の例を含んでいたが、これらの分子の比率はサブテロメア特異的であり、Ｕ２ＯＳでは３３：１（１９ｐ）から１：２５（１９ｑ）までであった。Saos-2細胞株は、組換えテロメアの同様の割合を示した。ＳＫ-ＭＥＬ-２の組換えサブテロメアの頻度（１１％）は、Ｕ２ＯＳおよびＳａｏｓ-２の組換えサブテロメアの頻度（それぞれ２４および１９％）の約半分である。末端（ＴＴＡＧＧＧＧ）ｎトラクトの長さおよび異質性レベル、テロメアシグナルフリー末端の頻度、および組換えテロメア融合接合部における保持された内部テロメア様配列（ＩＴＳ）の頻度およびサイズは、すべて、特定の細胞株に関与する特定のサブテロメアに応じて変化した。非常に大きな直鎖状の染色体外テロメアリピート（ECTR）DNA分子が3つの細胞株すべてで発見されました。これらの分子は、原則として、破断誘発修復（BIR）長繊維状DNA合成機構を介して新しい長繊維状テロメア・トラクトの合成をテンプレート化することができ、ALT細胞の特徴である非常に長い長繊維状テロメア・トラクトの長さと不均一性に寄与しています。最長のテロメア・トラクト（エンド・テロメアとリニアECTRの両方）の多くは、非正規テロメア・リピートの伸張が交差していることを示すパンクテートCRISPR/Cas9依存性（TTAGGG）のn標識パターンを示した。

RESULTS: Our results revealed loci-specific ALT telomere features. For example, while each subtelomere included examples of single molecules with terminal (TTAGGG) n tracts as well as examples of recombinant telomeric single molecules, the ratio of these molecules was subtelomere-specific, ranging from 33:1 (19p) to 1:25 (19q) in U2OS. The Saos-2 cell line shows a similar percentage of recombinant telomeres. The frequency of recombinant subtelomeres of SK-MEL-2 (11%) is about half that of U2OS and Saos-2 (24 and 19% respectively). Terminal (TTAGGG) n tract lengths and heterogeneity levels, the frequencies of telomere signal-free ends, and the frequency and size of retained internal telomere-like sequences (ITSs) at recombinant telomere fusion junctions all varied according to the specific subtelomere involved in a particular cell line. Very large linear extrachromosomal telomere repeat (ECTR) DNA molecules were found in all three cell lines; these are in principle capable of templating synthesis of new long telomere tracts via break-induced repair (BIR) long-tract DNA synthesis mechanisms and contributing to the very long telomere tract length and heterogeneity characteristic of ALT cells. Many of longest telomere tracts (both end-telomeres and linear ECTRs) displayed punctate CRISPR/Cas9-dependent (TTAGGG) n labeling patterns indicative of interspersion of stretches of non-canonical telomere repeats.

結論:

我々の新しい単一分子法を用いて、個々のサブテロメアを同定し、リンクされたテロメア（TTAGGG）nトラクトの長さと構造変化を特徴づけることで、ヒトALT細胞におけるテロメア損傷、修復、組換え機構の構造的帰結を、前例のない分子的詳細と、異なるALT陽性細胞株における有意な違いを明らかにしました。

CONCLUSION: Identifying individual subtelomeres and characterizing linked telomere (TTAGGG) n tract lengths and structural changes using our new single-molecule methodologies reveals the structural consequences of telomere damage, repair and recombination mechanisms in human ALT cells in unprecedented molecular detail and significant differences in different ALT-positive cell lines.