DNAの構造変化とナノ粒子の着地を監視するための三次元二色二重粒子追跡顕微鏡

Three-Dimensional Two-Color Dual-Particle Tracking Microscope for Monitoring DNA Conformational Changes and Nanoparticle Landings on Live Cells.

• Yen-Liang Liu
• Evan P Perillo
• Phyllis Ang
• Mirae Kim
• Duc Trung Nguyen
• Katherine Blocher
• Yu-An Chen
• Cong Liu
• Ahmed M Hassan
• Huong T Vu
• Yuan-I Chen
• Andrew K Dunn
• Hsin-Chih Yeh

抄録

ここでは、3次元2色二重粒子追跡(3D-2C-DPT)技術を紹介します。この技術は、3次元でスペクトル的に異なる2つのターゲットを同時に5ミリ秒までの時間分解能で定位させることができます。二重ターゲットは、33から250nmの距離で追跡することができ、追跡精度は約15nm(静的ターゲット)と約35nm(自由拡散ターゲット)である。各ターゲットは個別に定位しているため、相対的な3次元位置、2次元回転、2つのターゲット間の分離距離など、豊富なデータを抽出することができます。この手法を用いて、二本鎖DNA(dsDNA)で連結したダンベル状の二量体をナノスコピック光学定規にして、dsDNAリンカーの設計(1-nick, 3-nt, 6-nt, 9-nt一本鎖ギャップ)を操作することで、自由溶液中のニックやギャップを持つdsDNA分子の曲げダイナミクスを定量化したところ、3.2秒から10.7秒へと(直線から曲げへの)増加が見られたことが分かりました。次に、3D-2C-DPTを用いて、抗体を結合させたナノ粒子の細胞膜への着地時の並進運動と回転運動を観察し、膜受容体との相互作用による回転の低下を明らかにしました。本研究は、この3D-2C-DPT法が、生体分子の構造変化や細胞膜上での分子間相互作用を明らかにする新しいツールであることを示しています。

Here, we present a three-dimensional two-color dual-particle tracking (3D-2C-DPT) technique that can simultaneously localize two spectrally distinct targets in three dimensions with a time resolution down to 5 ms. The dual-targets can be tracked with separation distances from 33 to 250 nm with tracking precisions of ∼15 nm (for static targets) and ∼35 nm (for freely diffusing targets). Since each target is individually localized, a wealth of data can be extracted, such as the relative 3D position, the 2D rotation, and the separation distance between the two targets. Using this technique, we turn a double-stranded DNA (dsDNA)-linked dumbbell-like dimer into a nanoscopic optical ruler to quantify the bending dynamics of nicked or gapped dsDNA molecules in free solution by manipulating the design of dsDNA linkers (1-nick, 3-nt, 6-nt, or 9-nt single-strand gap), and the results show the increase of (linear to bent) from 3.2 to 10.7 s. The 3D-2C-DPT is then applied to observe translational and rotational motions of the landing of an antibody-conjugated nanoparticle on the plasma membrane of living cells, revealing the reduction of rotations possibly due to interactions with membrane receptors. This study demonstrates that this 3D-2C-DPT technique is a new tool to shed light on the conformational changes of biomolecules and the intermolecular interactions on plasma membrane.