PTEN 阻害は角膜内皮細胞の分裂と移行を促進し、角膜内皮創傷治癒を促進する

PTEN Inhibition Accelerates Corneal Endothelial Wound Healing through Increased Endothelial Cell Division and Migration.

• Weijie Zhang
• Fei Yu
• Chenxi Yan
• Chunyi Shao
• Ping Gu
• Yao Fu
• Hao Sun
• Xianqun Fan

抄録

目的:

角膜内皮細胞（CECs）の増殖と遊走を中心とした制御におけるホスファターゼとテンシンのホモログ（染色体10上に欠失したホスファターゼとテンシンのホモログ）の役割を調べ、ラットモデルの角膜内皮機能障害に対するPTEN阻害剤の適用性をさらに評価する。

Purpose: To investigate the role of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN) in the regulation of corneal endothelial cell (CECs) focusing on proliferation and migration, and to further evaluate the application of PTEN inhibitors in the treatment of corneal endothelial dysfunction in a rat model.

方法:

ヒトおよびラット角膜内皮におけるPTENの発現は、免疫細胞化学、ウエスタンブロッティングおよびELISAにより決定された。PTENの低分子阻害剤であるbpV(pic)を、ヒトCEC細胞株B4G12と器官培養ラット角膜をトランスフォーミング成長因子β2(TGF-β2)の存在下で培養し、細胞周期の状態をフローサイトメトリーとBrdU染色で測定した。細胞周期の状態はフローサイトメトリーとBrdU染色で検出した。内因性p27Kip1の細胞内局在を免疫細胞化学とウエスタンブロッティングで検出した。さらに、外因性トランスフェクションされたＹＦＰ-ｐ２７Ｋｉｐ１を蛍光顕微鏡下で観察した。細胞遊走は、創傷スクラッチモデルおよびトランスウェル浸潤アッセイを用いて調べた。最後に、bpV(pic)をラット角膜内皮損傷モデルに腔内注入した。創傷治癒過程をスリットランプ顕微鏡、光コヒーレンス・トモグラフィー、組織学的検査、走査型電子顕微鏡検査で評価した。

Methods: Expression of PTEN in human and rat corneal endothelium was determined by immunocytochemistry, western blotting, and ELISA. A small molecular inhibitor of PTEN, bpV(pic), was applied in the culture of human CEC cell line B4G12 and organ-cultured rat cornea in the presence of transforming growth factor beta 2 (TGF-β2). Cell cycle status was detected by flow cytometry and BrdU staining. Subcellular localization for endogenous p27Kip1 was detected by immunocytochemistry and western blotting. Moreover, exogenous transfected YFP-p27Kip1 was observed under a fluorescent microscope. Cell migration was examined with a wound scratch model and transwell invasion assay. Finally, bpV(pic) was intracamerally injected in a rat corneal endothelial injury model. The wound healing process was evaluated by slit lamp biomicroscopy, optical coherence tomography, histological and scanning electron microscope examination.

結果:

ヒト角膜内皮におけるPTENの発現はラットと比較して高く、ヒトCECの増殖能力がラットよりも相対的に低かったことが原因ではないかと推測される。bpV(pic)によるPTEN阻害は、p27Kip1の核蓄積を緩和し、p27Kip1の発現を低下させることで、TGF-β2誘導性CECのG1-arrestを逆転させることができた。さらに、bpV(pic)はTGF-β2と相乗的に作用してCECの遊走を促進した。 最後に、bpV(pic)をラットの角膜内皮創傷治癒モデルでは、bpV(pic)の口腔内投与により角膜内皮創傷治癒が促進されることを確認した。

Results: The expression of PTEN in human corneal endothelium was higher compared with rat, which we speculate was mostly responsible for the relatively less proliferation capacity of human CEC than rat. PTEN inhibition by bpV(pic) could reverse TGF-β2-induced CEC G1-arrest by alleviating p27Kip1 nuclear accumulation and decreasing total p27Kip1 expression. In addition, bpV(pic) promoted CEC migration, which acted synergistically with TGF-β2. Finally, intracameral injection of bpV(pic) could promote corneal endothelial wound healing in a rat model.

結論:

本研究は、PTENを標的とした角膜内皮機能障害治療薬の開発に向けた実験的基盤を提供するものである。

Conclusions: Our study provided experimental basis for the development of therapeutic agent targeting on PTEN for the treatment of corneal endothelial dysfunction.