低酸素のためのライブレポート：低酸素センサー修飾間葉系幹細胞をin vitroレポーターとして

Live reporting for hypoxia: hypoxia-sensor modified mesenchymal stem cells as in vitro reporters.

• Carola Schmitz
• Iliyana Pepelanova
• Dror Seliktar
• Ekaterina Potekhina
• Vsevolod V Belousov
• Thomas Scheper
• Antonina Lavrentieva

抄録

自然な酸素勾配は、生物の組織や三次元（3D）in vitro培養の文脈でも発生します。埋め込まれた細胞による酸素拡散制限と代謝酸素消費は、組織/マトリックス内に低酸素の領域を生成します。しかし、三次元細胞培養システムにおける酸素勾配や低酸素に対する細胞応答を検出するための信頼性の高いシステムはまだ存在しない。本研究では、遺伝子工学的に設計された蛍光低酸素センサーHRE-dUnaGを安定的に発現するように改変したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（hAD-MSCs）を用いて、3次元での酸素勾配を可視化するシステムを開発した。修飾した細胞は、増殖および分化能の点で幹細胞としての特徴を保持していた。この低酸素レポーター細胞を、可変酸素濃度（2.5%O2, 5%O2, 7.5%O2）下で蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて評価した。その結果、レポーターhAD-MSCsの出力は異なる酸素濃度に敏感であり、再酸素化後に速い減衰速度を示すことが明らかになった。さらに、モデル3D細胞培養アプリケーションにおけるセンサー応答を調べるために、レポーター細胞を細胞数を変化させたバルクヒドロゲルにカプセル化した。MSCに基づく低酸素レポーター細胞の使用は、真のin vivo細胞微小環境にアプローチするための貴重なツールを表し、AD-MSCsの再生可能性のより良い理解を可能にします。この記事は著作権で保護されています。すべての権利を保有しています。

Natural oxygen gradients occur in tissues of biological organisms and also in the context of three-dimensional (3D) in vitro cultivation. Oxygen diffusion limitation and metabolic oxygen consumption by embedded cells produce areas of hypoxia in the tissue/matrix. However, reliable systems to detect oxygen gradients and cellular response to hypoxia in 3D cell culture systems are still missing. In this study, we developed a system for visualization of oxygen gradients in 3D using human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSCs) modified to stably express a fluorescent genetically-engineered hypoxia sensor HRE-dUnaG. Modified cells retained their stem cell characteristics in terms of proliferation and differentiation capacity. The hypoxia reporter cells were evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry under variable oxygen levels (2.5% O2, 5% O2 and 7.5% O2). We demonstrated that reporter hAD-MSCs output is sensitive to different oxygen levels and displays fast decay kinetics after reoxygenation. Additionally, the reporter cells were encapsulated in bulk hydrogels with a variable cell number, in order to investigate the sensor response in model 3D cell culture applications. The use of hypoxia-reporting cells based on MSCs represents a valuable tool for approaching the genuine in vivo cellular microenvironment and will allow a better understanding of the regenerative potential of AD-MSCs. This article is protected by copyright. All rights reserved.

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