液体マイクロジャンクション表面サンプリング-質量分析法を用いた迅速で包括的なリピドミクス分析のためのTiO2コーティング上のグリセロリン脂質からの糖脂質/スフィンゴ脂質の分離

Separation of Glycolipids/Sphingolipids from Glycerophospholipids on TiO2 Coating in Aprotic Solvent for Rapid Comprehensive Lipidomic Analysis with Liquid Microjunction Surface Sampling-Mass Spectrometry.

• Zehui Huang
• Qian Wu
• Hongmei Lu
• Yang Wang
• Zhimin Zhang

抄録

直接質量分析法(MS)によるリピドミクス分析では、イオン化度の高い脂質(グリセロリン脂質など)はイオン化度の低い脂質(糖脂質、スフィンゴ脂質、グリセリドなど)にイオン抑制がかかり、リピドミクスの検出範囲が大きく制限されます。本研究では、TiO2ベースの液体マイクロジャンクション表面サンプリング(LMJSS)とMSを組み合わせて、生体試料中のグリセリド、リン脂質、糖脂質/スフィンゴ脂質を分離し、リピドームカバレッジの高い異なるクラスの脂質を迅速に分析するために使用しました。その結果、グリコシル基やスフィンゴシン基を持つ脂質とリン酸基を持つ脂質は、非水系のアプロティック溶媒中で、溶媒組成を調整することにより、TiO2上で共濃縮した後、選択的に分離できることを見いだしました（選択性>10）。そこで、バイオサンプルを中性アプロティック溶媒中でTiO2スライドに装填し、LMJSSプローブを用いて、純アセトニトリル中のグリセリド、6%アンモニア-94%アセトニトリル(v/v)中のグリセロリン脂質、5%ギ酸-95%メタノール(v/v)中の糖脂質/スフィンゴ糖脂質をTiO2スライドから順次溶出させることにより、選択的な多段階抽出法を開発しました。TiO2スライドからの各溶出液は、LMJSSにより直接MSに送出して分析した。3 段階の脱離ステップの合計検出時間は 3 分間に制御されています。各脂質クラスに対する方法の性能を脂質標準物質を用いて評価し、マトリックス効果（107-128％）、RSD（0.4-16％）、直線性（0.98-0.99）、検出限界（5-3000 ng/mL）、TiO2コーティングされたスライドの脂質に対する吸着平衡定数（102-104）および吸着容量（1-38 µg/mm2）を含んでいる。最後に、TiO2を用いたLMJSS-MS法を血漿及び脳組織のリピドミクス分析に適用し、直接注入MSと比較した。その結果、直接注入MS法と比較して、血漿中及び脳組織中のスフィンゴ脂質/糖脂質が2〜5倍、グリセロリン脂質/グリセリドが40〜50倍検出された。検出された脂質は標準添加校正法で定量し、TiO2ベースのLMJSS-MSで測定した絶対定量結果は、従来のLC-MS法との比較で検証した（相関係数>0.98、相関線の傾き=0.87-1.05）。

In lipidomic analysis by direct mass spectrometry (MS), high abundance lipids with high ionizability (such as glycerophospholipids) would cause ion suppression to lipids with poor ionizability and low abundance (such as glycolipids, sphingolipids or glycerides), which largely limits the detection coverage for lipidomics. In this work, TiO2-based liquid microjunction surface sampling (LMJSS) coupled with MS was used for separation of glycerides, phospholipids and glycolipids/sphingolipids in biological samples and rapid analysis of lipids in different classes with high lipidome coverage. We found that, in non-aqueous aprotic solvents, lipids with glycosyl or sphingosine group could be selectively separated from lipids with phosphate group (selectivity>10) after being co-enriched on TiO2 by tuning the solvent composition. Accordingly, a selective multistep extraction method was developed by loading the biosamples on TiO2 slides in neutral aprotic solvent, and sequentially eluting glycerides in pure acetonitrile, glycerophospholipids in 6% ammonia-94% acetonitrile (v/v) and glycolipids/sphingolipids in 5% formic acid-95% methanol (v/v) by LMJSS probe from TiO2 slide. Each eluate from TiO2 slide was directly delivered by LMJSS to MS for analysis. The total detection time with three desorption steps would be controlled in 3 mins. The method performance for each lipid class was evaluated using lipid standards, including matrix effects (107-128%), RSDs (0.4-16%), linearity (0.98-0.99), detection limits (5-3000 ng/mL), the adsorption equilibrium constants (102-104) and adsorption capacity (1-38 µg/mm2) of TiO2 coated slides to lipids. Finally, the TiO2-based-LMJSS-MS method was applied to lipidomic analysis for blood plasma and brain tissue, and compared with direct infusion MS. Results showed that (2-5)-fold more sphingolipids/glycolipids and 40-50 more glycerophospholipids/glycerides were identified in both plasma and brain extract by the new method comparing with direct infusion MS method. Detected lipids were quantified with standard addition calibration method, and the absolute quantitation results measured by TiO2-based-LMJSS-MS were verified with that by the traditional LC-MS method (correlation coefficient >0.98, slope of correlation line=0.87-1.05).