乳酸脱水素酵素D-LDH1がFructobacillus tropaeoli CRL 2034の乳酸合成に大きな役割を果たしています

Major role of lactate dehydrogenase D-LDH1 for the synthesis of lactic acid in Fructobacillus tropaeoli CRL 2034.

• Juliana Bleckwedel
• Florencia Mohamed
• Fernanda Mozzi
• Raúl Ricardo Raya

抄録

乳酸脱水素酵素D-およびL-乳酸脱水素酵素は、それぞれピルビン酸のD(+)-およびL(-)-乳酸への還元に関与している。イチジク由来のFructobacillus tropaeoli CRL 2034は、D-乳酸とL-乳酸を9:1の割合で産生する。本研究では、CRL 2034ゲノムから2つのD-ldh遺伝子（ldh1とldh2）と1つのL-ldh遺伝子（ldh3）を発見した。対照的に、ldh3は、308-aaタンパク質をコードする927-bpの遺伝子である。ldh1/ldh2とldh3の間の同一性は48％よりも低かった。フルクトバチルス菌株による乳酸合成におけるこれらの遺伝子の役割を解明するために、各遺伝子のプラスミド挿入変異体を作製し、特徴付けを行った。その結果、CRL2034 ldh1::pRV300 細胞においてのみ生育動態に影響があり、この変異体は乳酸産生量が最も少なく（野生型では 6.36±0.67 g/L に対し 4.50±0.15 g/L）、D/L 比は 7.1:2.9 であった。これらの結果から、ldh1遺伝子が本研究株の乳酸産生に主に関与していることが明らかになった。また、Fructobacillus 5種の菌株間で比較解析を行ったところ、D-LDHタンパク質の同一性は70％以上、L-LDHタンパク質の同一性は60％以上であった。最後に、D-LDHとL-LDHの系統解析を行った結果、D-LDHのみがFructobacillusと進化的に近縁な属間の系統進化と一致していることが明らかになった。Key Points -Fructobacillus tropaeoli CRL 2034株は3つのLDH遺伝子をゲノムに保有しており、LDH1とLDH2はD-乳酸脱水素酵素を、LDH3はL-乳酸脱水素酵素をコードしている。

The enzymes D- and L-lactate dehydrogenase are involved in the reduction of pyruvate to D(+)- and L(-)-lactate, respectively. The fig-origin strain Fructobacillus tropaeoli CRL 2034 produces D- and L-lactic acids in a 9:1 ratio. In this work, two D-ldh (ldh1 and ldh2) and one L-ldh (ldh3) genes were found in the CRL 2034 genome. ldh1 and ldh2 are homologous (79% identity) and organized as contiguous operons, each gene containing 996 base pair (bp) and encoding for a 331-amino acid (aa) protein (74% identity). In contrast, ldh3 is a 927-bp gene coding for a 308-aa protein. The identity between ldh1/ldh2 and ldh3 was lower than 48%. To elucidate the role of these genes in the synthesis of lactic acid by the Fructobacillus strain, plasmid insertion mutants in each gene were generated and characterized. The growth kinetic parameters were affected only in CRL2034 ldh1::pRV300 cells, this mutant showing the lowest total lactic acid production (4.50 ± 0.15 versus 6.36 ± 0.67 g/L of wild-type strain), with a D/L ratio of 7.1:2.9. These results showed that the ldh1 gene is primarily responsible for lactic acid production by the studied strain. A comparative analysis among strains of the five Fructobacillus species revealed that the identity of D-LDH proteins was higher than 70%, while the identity of L-LDH was over 60%. Finally, phylogenetic analysis of D- and L-LDHs revealed that only D-LDH phylogeny was consistent to the phylogenetic evolution among Fructobacillus and evolutionarily related genera. Key Points •F. tropaeoli CRL 2034 harbors three ldh genes in its genome. •ldh1 and ldh2 encode D-lactate dehydrogenase; ldh3 encodes L-lactate dehydrogenase. •Gene ldh1 plays the major role in lactic acid production by strain CRL 2034. •Fructobacillus D-LDH phylogeny was consistent to phylogenetic evolution.