Cas13をターゲットとしたgRNAの構造設計

Structure-based design of gRNA for Cas13.

• Srinivas Bandaru
• Mika Higashide Tsuji
• Yurika Shimizu
• Kaya Usami
• Suni Lee
• Naoko Kumagai Takei
• Kei Yoshitome
• Yasumitsu Nishimura
• Takemi Otsuki
• Tatsuo Ito

抄録

Cas13 エンドヌクレアーゼ活性は、RNA の局所的な二次構造に依存しており、一本鎖（SS）領域を強く好むことが知られている。このため、Cas13エンドヌクレアーゼの活性はRNAの二次構造に依存しており、RNAの二次構造は一本鎖(SS)領域を強く好むことがわかっている。本研究では、実験的な構造解析データと予測された構造モデルを統合した合理的なgRNAデザインを提案する。XIST の構造解析データを用いて、SS 領域を標的とした gRNA は、二本鎖（DS）領域を標的とした gRNA と比較して有意にノックダウンと切断を誘導することを確認した。さらに、SS 領域を標的とした場合、Cas13 を介した開裂を効率的に促進する gRNA の「中央シード領域」を同定した。さらに、実験的な構造解析データが得られない場合を想定し、滑膜肉腫で確認されている SS18-SSX2 融合転写物を用いて、その構造を計算機的に予測しました。その結果、構造から予測されたSS領域を標的としたgRNAは、DS領域を標的としたgRNAに比べて効率的に壊死を誘導することが確認された。以上のことから、RNA のノックダウンを効果的に行うためには、構造情報を利用して SS 領域を特異的に標的とする gRNA を設計することが重要であると考えられる。さらに、この戦略は、特に lncRNA を標的とする場合には、（SS 領域のみを標的とした）gRNA デザインの探索空間を狭めることが期待できる。

Cas13 endonuclease activity depends on the RNA local secondary structure with strong preference for single-stranded (SS) regions. Hence, it becomes indispensable to identify the SS regions for effective Cas13 mediated RNA knockdown. We herein present rational gRNA design by integrating experimental structure-seq data and predicted structural models. Utilizing structure-seq data for XIST transcript, we observed that gRNAs targeting the SS regions significantly induce transcript knockdown and cleavage than those targeting double-stranded (DS) regions. Further, we identified the "central seed region" in the gRNA that upon targeting the SS regions efficiently facilitates Cas13 mediated cleavage. In our following pursuits, we considered the scenario wherein experimental structure-seq data is not available, hence we used SS18-SSX2 fusion transcript indicated in synovial sarcomas and computationally predicted its structure. We observed that gRNAs targeting the SS regions predicted from the structure, efficiently induced necrosis compared to gRNAs that target the DS regions. In conclusion, for the effective RNA knockdown, the Cas13 mediated targeting strategy presented herein emphasizes the designing of gRNAs specifically targeting SS regions by utilizing structural information. Further, this strategy, in turn, can be anticipated to narrow the search space for gRNA design (by exclusively targeting SS regions) especially when lncRNAs are the targets.