血管新生アナライザー for ImageJ - 「内皮管形成アッセイ」と「フィブリンビーズアッセイ」の比較形態解析

Angiogenesis Analyzer for ImageJ - A comparative morphometric analysis of "Endothelial Tube Formation Assay" and "Fibrin Bead Assay".

• Gilles Carpentier
• Sarah Berndt
• Ségolène Ferratge
• Wayne Rasband
• Muriel Cuendet
• Georges Uzan
• Patricia Albanese

抄録

内皮細胞（EC）のインビトロ毛細血管様成長に基づく血管新生アッセイは、抗血管新生薬やプロ血管新生薬の効果を評価したり、様々なタイプのECや前駆細胞の機能的能力を試験したり比較したりするために広く利用されています。血管新生を研究するために適用される様々な方法の中で、最も一般的に使用されているのは、「内皮管形成アッセイ」（ETFA）である。適切な培養条件では、ECは、メッシュ化された擬似毛細血管ネットワークにつながることができる2次元（2D）の分岐構造を形成する。ETFAの代替的なアプローチは、「フィブリンビーズアッセイ」（FBA）であり、サイトデックス3マイクロスフィアの使用に基づいており、コーティングされたECから3D毛細血管様パターンの成長を促進し、高スループットのインビトロ血管新生研究に適しています。これら2つの広く使用されているアッセイの解析評価は、観察方法や画像解析の点で依然として困難な状況にあります。我々はこれまでに、ETFA 由来の画像を擬似毛細血管ネットワークの特性に応じて解析できる ImageJ (AA) 用の血管新生解析ツール「Angiogenesis Analyzer」を開発してきた。本研究では、FBAモデルから微小球を認識し、付着した毛細血管様構造を解析するためのアルゴリズムを開発し、実装した。このような手法は、非破壊的な画像取得を用いた完全自動化モードで初めて公開された。我々は、これらの2つのアルゴリズムを詳述し、新しいAA版を使用して、ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）のモデル血管新生パターンに対する効率、精度、統計的妥当性において、両方の方法（すなわちETFAとFBA）を比較した。2つの方法は同じ生物学的ステップを評価するものではありませんが、我々のデータは、血管新生プロセスの解析に特異的かつ相補的な情報を表示することを示唆しています。

Angiogenesis assays based on in vitro capillary-like growth of endothelial cells (EC) are widely used, either to evaluate the effect of anti- and pro-angiogenesis drugs of interest, or to test and compare the functional capacities of various types of EC and progenitor cells. Among the different methods applied to study angiogenesis, the most commonly used is the "Endothelial Tube Formation Assay" (ETFA). In suitable culture conditions, EC form two-dimensional (2D) branched structures that can lead to a meshed pseudo-capillary network. An alternative approach to ETFA is the "Fibrin Bead Assay" (FBA), based on the use of Cytodex 3 microspheres, which promote the growth of 3D capillary-like patterns from coated EC, suitable for high throughput in vitro angiogenesis studies. The analytical evaluation of these two widely used assays still remains challenging in terms of observation method and image analysis. We previously developed the "Angiogenesis Analyzer" for ImageJ (AA), a tool allowing analysis of ETFA-derived images, according to characteristics of the pseudo-capillary networks. In this work, we developed and implemented a new algorithm for AA able to recognize microspheres and to analyze the attached capillary-like structures from the FBA model. Such a method is presented for the first time in fully automated mode and using non-destructive image acquisition. We detailed these two algorithms and used the new AA version to compare both methods (i.e. ETFA and FBA) in their efficiency, accuracy and statistical relevance to model angiogenesis patterns of Human Umbilical Vein EC (HUVEC). Although the two methods do not assess the same biological step, our data suggest that they display specific and complementary information on the angiogenesis processes analysis.