技術ノート：ウシ胚外胚葉内胚葉細胞の生成効率を向上させる

Technical note: Improving the efficiency of generating bovine extraembryonic endoderm cells.

• Mary K Smith
• Catherine C Clark
• Sarah R McCoski

抄録

余分な胚性内胚葉（XEN）の形成は、胚発生の初期に起こります。XENから発生する細胞型は、適切な細胞培養モデル系がないため、反芻動物種ではまだ十分に研究されていません。本研究の目的は、ウシ胚盤胞からXEN細胞培養物を生産するためのプロトコルを確立することであった。これまでの研究により、線維芽細胞増殖因子 2（FGF2）がウシ XEN 発現の促進因子であることが確認されています。ここで研究した培養条件のさらなる改良は、20％のウシ胎児血清とFGF2補充への曝露が含まれています。これらの改良により、内胚葉外胚葉形成率は81.6±5.5％であったのに対し、ウシ血清アルブメン補充（BSA）対照では33.3％±5.5％であった。これらの細胞は、形態学的に調べるとXENに類似しており、内臓（BNIP1、VEGFA）および頭頂部（CXCR4、THBD、HHEX）のXENに存在する転写物と同様に、XEN転写物（GATA4、GATA6）を含んでいた。2つのXEN細胞株を長期培養のために維持した。両方の細胞株は、産毛になる前に約6週間増殖を続けた。これらの細胞株は XEN に似た状態を維持し、GATA4 と GATA6 を発現し続けた。培養を続けると、内臓および頭頂部のXEN転写産物の豊富さの増加が観察され、これらの細胞は自然分化を経ているか、あるいは様々なXEN細胞型を形成する能力を保持していることが示唆された。凍結融解法に曝露した培養細胞ストックは、非凍結細胞と同様の表現型および遺伝子型の挙動を示した。結論として、ウシ初代XEN細胞培養物の効率的な生産方法が開発された。この新しいプロトコールは、この見落とされていた細胞型が胚発生期の栄養供給に果たす役割を研究者が探究するのに役立つ可能性がある。

The formation of extra embryonic endoderm (XEN) occurs early in embryonic development. The cell types that develop from the XEN remain poorly studied in ruminant species because of the lack of suitable cell culture model systems. The goal of this work was to establish a protocol for producing XEN cell cultures from bovine blastocysts. Previous work identified fibroblast growth factor 2 (FGF2) as a facilitator of bovine XEN development. Further refinements in culture conditions studied here included exposure to 20% fetal bovine serum and FGF2 replenishment. These modifications yielded an endoderm outgrowth formation incidence of 81.6 ± 5.5% compared to 33.3% ± 5.5% in bovine serum albumen-supplemented (BSA) controls. These cells resembled XEN when examined morphologically and contained XEN transcripts (GATA4, GATA6) as well as transcripts present in visceral (BNIP1, VEGFA) and parietal (CXCR4, THBD, HHEX) XEN. Two XEN cell lines were maintained for prolonged culture. Both lines continued to proliferate for approximately 6 wk before becoming senescent. These cultures maintained an XEN-like state and continued to express GATA4 and GATA6 until senescence. An increase in abundance of visceral and parietal XEN transcripts was observed with continued culture, suggesting these cells either undergo spontaneous differentiation or retain the ability to form various XEN cell types. Stocks of cultured cells exposed to a freeze-thaw procedure possessed similar phenotypic and genotypic behaviors as non-frozen cells. To conclude, a procedure for efficient production of primary bovine XEN cell cultures was developed. This new protocol may assist researchers in exploring this overlooked cell type for its roles in nutrient supply during embryogenesis.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of the American Society of Animal Science. All rights reserved. For permissions, please e-mail: journals.permissions@oup.com.