シアル酸リンケージ決定を用いたO-グリコペプチド特性評価のためのO-GIGの最適化

Optimization of O-GIG for O-glycopeptide Characterization with Sialic Acid Linkage Determination.

• Shuang Yang
• Wells W Wu
• Rongfong Shen
• Jonathan Sjogren
• Lisa Parsons
• John F Cipollo

抄録

O-グリコタンパク質の分析は、O-グリカンの放出で活性な利用可能な酵素が不足していることもあり、歴史的に困難なものとなっています。さらに、β-除去/マイケル付加などの化学放出法は、O-グリカンの放出に特異的ではなく、ホスホリル置換を除去することもできます。これらの事象の両方とも、脱アミド化されたセリンおよびスレオニンを残し、したがって、曖昧な構造的結論を導くことができる。最近、腸内細菌由来で大腸菌で発現するO-プロテアーゼOpeRATORが市販されるようになった。O-グリコプロテインを消化すると、セリン/スレオニンのN末端で切断されたO-グリコペプチドが得られ、O-グリカンはそのまま残っています。この酵素は広範な基質特異性を有し、哺乳類コア１〜８を含む。しかし、OpeRATORはシアル化糖タンパク質に対しては完全には活性がないため、消化前にこの酸性残基を除去することで構造情報を犠牲にすることが示唆されている。本研究では、特にシアル化糖複合体に対する酵素活性を最適化するために、緩衝液の選択、pH、シアル酸修飾、消化温度などの様々な条件でOpeRATORの性能を調べました。本研究で得られた条件は、完全にシアル化されたO-グリコペプチドのOpeRATOR消化を容易にし、シアルリンケージを同定するために大量にタグ付けされているため、生物学的プロセスで重要な荷電したO-グリコペプチドの分析を容易にします。

O-glycoprotein analysis has been historically challenging due, in part, to a dearth of available enzymes active in release of O-glycans. Moreover, chemical releasing methods, such as β-elimination/Michael addition are not specific to O-glycan release and can also eliminate phosphoryl substitutions. Both of these events leave behind deaminated serine and threonine and thus can lead to ambiguous structural conclusions. Recently, the O-protease OpeRATOR, derived from intestinal bacteria and expressed in E. coli, has become commercially available. Digestion of O-glycoprotein yields O-glycopeptides cleaved at the N-terminal end of serine/threonine with O-glycan remaining intact. The enzyme has broad substrate specificity and includes mammalian Cores 1-8. However, OpeRATOR is not fully active toward sialylated glycoproteins and therefore it is suggested that this acidic residue be removed prior to digestion, thus, sacrificing structural information. In this study, we investigated the performance of OpeRATOR under a range of conditions, including buffer selection, pH, sialic acid modification, and digestion temperature in order to optimize enzymatic activity with special emphasis on sialylated glycosites. Conditions derived in this work facilitate OpeRATOR digestion of fully sialylated O-glycopeptides mass tagged to identify the sialyl linkage, thus, facilitating analysis of these charged O-glycopeptides, which are often important in biological processes.