相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に及ぼす蛍光体クエンチャー相互作用の影響

Fluorophore-Quencher Interactions Effect on Hybridization Characteristics of Complementary Oligonucleotides.

• Zackary A Zimmers
• Nicholas M Adams
• William E Gabella
• Frederick R Haselton

抄録

核酸はしばしば蛍光レポーター分子と共有結合的に修飾され、ハイブリダイゼーション状態に依存した光信号を生成する。このような核酸レポーターの設計には、蛍光体、蛍光消光剤、蛍光消光設計の選択が必要である。本報告書では、これらの選択がDNAハイブリダイゼーション特性に及ぼす影響について、6種類の蛍光体を4つのクエンチングスキーム（蛍光体から0、5、または10塩基オフセットしたクエンチャー分子、およびヌクレオチドクエンチング）で検討することで概説した。左利きのL-DNAの類似した結合特性を右利きのDNAと比較して評価し、各クエンチングスキームの効果を定量化した。これらの結果は、蛍光標識されたＬ-ＤＮＡを反応中の類似の標識されていないＤ-ＤＮＡのセンチネルとしてモニターするアダプティブＰＣＲ法に適用した。試験したすべてのフルオロフォアおよび消光スキームは、ラベルされていないオリゴヌクレオチドと比較して、0.5から8.5℃の範囲の値でオリゴヌクレオチド対のアニーリング温度を増加させた。最小の増加（0.5℃）を有するデザインは、FAM蛍光体を有するセンスストランドと、FAMから10塩基オフセットされたブラックホールクエンチャー2を有するアンチセンスストランドであった。クエンチャー分子をオフセットしない同一のデザインは、５℃のアニーリング温度のシフトをもたらした。これらのL-DNAデザインのそれぞれに基づいて温度スイッチングを用いてPCRを行ったところ、アニーリング温度のシフトが最も小さい10塩基オフセットデザインの方が効率が大幅に向上しました。これらの結果は、核酸光シグナルのための適切な蛍光消光スキームを選択することの重要性を強調している。

Nucleic acids are often covalently modified with fluorescent reporter molecules to create a hybridization state-dependent optical signal. Designing such a nucleic acid reporter involves selecting a fluorophore, quencher, and fluorescence quenching design. This report outlines the effect that these choices have on the DNA hybridization characteristics by examining six fluorophores in four quenching schemes: a quencher molecule offset from the fluorophore by 0, 5, or 10 bases, and nucleotide quenching. The similar binding characteristics of left-handed L-DNA were evaluated in comparison with right-handed DNA to quantify the effect of each quenching scheme. These results were applied to the Adaptive PCR method, which monitors fluorescently-labeled L-DNA as a sentinel for analogous unlabeled D-DNA in the reaction. All of the tested fluorophores and quenching schemes increased the annealing temperature of the oligonucleotide pairs by values ranging from 0.5 to 8.5 °C relative to unlabeled oligonucleotides. The design with the smallest increase (0.5 °C) was a sense strand with a FAM fluorophore and an anti-sense strand with Black Hole Quencher 2 offset by 10 bases from the FAM. An identical design that did not offset the quencher molecules resulted in a shift in annealing temperature of 5 °C. PCR was performed using temperature switching based on each of these L-DNA designs, and efficiency was significantly increased for the 10-base offset design, which had the smallest shift in annealing temperature. These results highlight the importance of selecting an appropriate fluorescence quenching scheme for nucleic acid optical signals.