このように、PacBio の一分子ロングリードシークエンシングは、Pinctada fucata martensii のトランスクリプトームの複雑さと多様性を解明することができた

PacBio single molecule long-read sequencing provides insight into the complexity and diversity of the Pinctada fucata martensii transcriptome.

• Hua Zhang
• Hanzhi Xu
• Huiru Liu
• Xiaolan Pan
• Meng Xu
• Gege Zhang
• Maoxian He

抄録

背景:

真珠貝Pinctada fucata martensiiは、海水真珠生産のための経済的に貴重な貝類であり、真珠の生産はその成長に依存している。この種の成長の分子機構は、現在のところよくわかっていません。このような複雑な生育メカニズムを理解するために、トランスクリプトーム配列の解析が検討されてきました。最近公開されたP. f. martensiiのゲノム配列とPacific Bioscience (PacBio)の単分子シークエンシング技術は、これらの分子メカニズムを徹底的に調査する機会を提供します。

BACKGROUND: The pearl oyster Pinctada fucata martensii is an economically valuable shellfish for seawater pearl production, and production of pearls depends on its growth. To date, the molecular mechanisms of the growth of this species remain poorly understood. The transcriptome sequencing has been considered to understanding of the complexity of mechanisms of the growth of P. f. martensii. The recently released genome sequences of P. f. martensii, as well as emerging Pacific Bioscience (PacBio) single-molecular sequencing technologies, provide an opportunity to thoroughly investigate these molecular mechanisms.

結果:

ここでは、PacBioの単一分子長読シーケンシング（PacBio sequencing）とIlluminaのシーケンシングを組み合わせて、全長トランスクリプトームを解析しました。合計20.65Gbのクリーンデータが生成され、その中には57万4,561個の円形コンセンサスリードが含まれており、その中から443,944個の完全長ノンキメラ（FLNC）配列が同定された。FLNCリードの転写クラスタリング解析により、32,095個の高品質コンセンサス配列を含む32,755個のコンセンサスアイソフォームが同定された。冗長なリードを除去した後、16,388個の転写産物が得られ、コンセンサス配列の融合転写産物予測を行うことで641個の融合転写産物が導出された。冗長性を考慮した後、16,388本の転写物の代替スプライシング解析を行ったところ、新規遺伝子座1607本、新規発見転写物14,946本を含む9097本の遺伝子座が検出された。染色体上の11,235個の遺伝子の元の境界を修正し、12,025個の完全オープンリーディングフレーム配列と635個のロングノンコーディングRNA（LncRNA）を予測し、13,482個の新規転写産物の機能的アノテーションを達成した。2,318個の代替スプライシングイベントが検出された。その結果、最大の真珠貝（L）と最小の真珠貝（S）の間で、合計228個の異なる発現を示す転写物（DET）が同定された。その結果、L 型は S 型と比較して、それぞれ 99 個と 129 個の有意な上昇と下降の DET が確認された。これらの DET のうち 6 つの DET は、独立した実験で定量的リアルタイム RT-PCR（RT-qPCR）によってさらに確認された。

RESULTS: Herein, the full-length transcriptome was analysed by combining PacBio single-molecule long-read sequencing (PacBio sequencing) and Illumina sequencing. A total of 20.65 Gb of clean data were generated, including 574,561 circular consensus reads, among which 443,944 full-length non-chimeric (FLNC) sequences were identified. Through transcript clustering analysis of FLNC reads, 32,755 consensus isoforms were identified, including 32,095 high-quality consensus sequences. After removing redundant reads, 16,388 transcripts were obtained, and 641 fusion transcripts were derived by performing fusion transcript prediction of consensus sequences. Alternative splicing analysis of the 16,388 transcripts was performed after accounting for redundancy, and 9097 gene loci were detected, including 1607 new gene loci and 14,946 newly discovered transcripts. The original boundary of 11,235 genes on the chromosomes was corrected, 12,025 complete open reading frame sequences and 635 long non-coding RNAs (LncRNAs) were predicted, and functional annotation of 13,482 new transcripts was achieved. Two thousand three hundred eighteen alternative splicing events were detected. A total of 228 differentially expressed transcripts (DETs) were identified between the largest (L) and smallest (S) pearl oysters. Compared with the S, the L showed 99 and 129 significantly up-and down-regulated DETs, respectively. Six of these DETs were further confirmed by quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR) in independent experiment.

結論:

私たちの結果は、既存の遺伝子モデルやゲノムアノテーションを大幅に改善し、ゲノム構造を最適化し、P. f. martensiiの異なる成長パターンの複雑さと多様性をより深く理解することができました。

CONCLUSIONS: Our results significantly improve existing gene models and genome annotations, optimise the genome structure, and in-depth understanding of the complexity and diversity of the differential growth patterns of P. f. martensii.