URA3リサイクルによる工業用天使酵母由来株の染色体へのセルラーゼコード遺伝子の反復的δ統合

Repetitive δ-integration of a cellulase-encoding gene into the chromosome of an industrial angel yeast -derived strain by URA3 recycling.

• Shaolan Zou
• Sifan Sun
• Xiaomao Zhang
• Jiaman Li
• Jinghan Guo
• Jiefang Hong
• Yuanyuan Ma
• Minhua Zhang

抄録

工業用酵母の遺伝子組み換えは、実験室での遺伝子組み換えよりも困難な場合が多く、新しいアプローチが求められています。そのため、新たなアプローチが求められています。本研究では、エンジェル酵母由来のハプロイド株Kαを、URA3リサイクルを介して達成された複数回のδ統合により遺伝子組換えを行った。3つのδ統合プラスミド、pGδRU、pGδRU-BGLおよびpGδRU-EGは、最初に、2つの167bpのδ配列とURA3-リピートフラグメントを用いて構築された。次いで、線形化されたpGδRU-BGLまたはpGδRU-EGフラグメントをそれぞれ一度だけ形質転換することにより、bgl1またはegl2遺伝子を含むδ統合株を得ることに成功した。URA3遺伝子をループアウトしたそれらの対応するものもまた、5´-FOAプレート上での増殖のための選択によって容易に単離されたが、対応する統合セルラーゼコード遺伝子のコピー数の増加に伴い、コロニーの総数に対するURA3を欠いたコロニーの割合は減少した。同様の結果は、第１ラウンドで得られたδ統合株Kα(δ::bgl1-repeat)を線形化されたpGδRU-EGフラグメントで形質転換したδ統合の第２ラウンドにおいても観察された。10ラウンドの細胞増殖および新鮮な培地への移行後、Kα(δ::bgl1-repeat)、Kα(δ::egl2-repeat)およびKα(δ::bgl1-repeat)(δ::egl2-repeat)の倍数時間および酵素活性は、有意な変化を示さず、安定していた。さらに、前処理したコーンコブの7日間の同時糖化および発酵中の最大エタノール濃度は、それぞれ46.35, 33.13および51.77g/Lであり、これらはすべて親Kα株よりも実質的に高い値であった。このように、URA3のリサイクルに伴う反復的なδ統合は、エンジェル酵母の遺伝子工学のための実行可能で価値のある方法となり得ることがわかりました。また、これらの結果は、δ統合遺伝子の構造安定性や、個々の統合部位が遺伝子発現に及ぼす影響など、δ統合に関連する重要な課題についての手がかりを提供するものである。これらの問題点をさらに解明することで、工業的な酵母育種におけるδ-統合に基づく手法の可能性を十分に発揮できるようになる。この記事は著作権で保護されています。無断転載を禁じます。

Genetic modification of industrial yeast strains often faces more difficulties than that of laboratory strains. Thus, new approaches are still required. In this research, the Angel Yeast-derived haploid strain Kα was genetically modified by multiple rounds of δ-integration, which was achieved via URA3 recycling. Three δ-integrative plasmids, pGδRU, pGδRU-BGL and pGδRU-EG, were first constructed with two 167 bp δ sequences and a repeat- URA3-repeat fragment. Then the δ-integrative strains containing the bgl1 or egl2 gene were successfully obtained by one-time transformation of the linearized pGδRU-BGL or pGδRU-EG fragment, respectively. Their counterparts in which the URA3 gene was looped out were also easily isolated by selection for growth on 5´-FOA plates, although the ratio of colonies lacking URA3 to the total number of colonies decreased with increasing copy number of the corresponding integrated cellulase-encoding gene. Similar results were observed during the second round of δ-integration, in which the δ-integration strain Kα(δ::bgl1-repeat) obtained from the first round was transformed with a linearized pGδRU-EG fragment. After ten rounds of cell growth and transfer to fresh medium, the doubling times and enzyme activities of Kα(δ::bgl1-repeat), Kα(δ::egl2-repeat) and Kα(δ::bgl1-repeat)(δ::egl2-repeat) showed no significant change and were stable. Further, their maximum ethanol concentrations during simultaneous saccharification and fermentation of pretreated corncob over a 7-day period were 46.35, 33.13 and 51.77 g/L, respectively, which were all substantially higher than the parent Kα strain. Thus, repetitive δ-integration with URA3 recycling can be a feasible and valuable method for genetic engineering of Angel Yeast. These results also provide clues about some important issues related to δ-integration, such as the structural stability of δ-integrated genes and the effects of individual integration-site locations on gene expression. Further be elucidation of these issues should help to fully realize the potential of δ-integration-based methods in industrial yeast breeding. This article is protected by copyright. All rights reserved.

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