免疫蛍光によるDNA修復タンパク質の相互作用の可視化

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence.

• Bárbara de la Peña Avalos
• Eloïse Dray

抄録

哺乳類の細胞は常に化学物質、放射線、自然発生的な代謝副産物にさらされており、特定のタイプの DNA 損傷を生じさせている。遺伝毒性物質はDNAのバックボーンを損傷したり、破壊したり、個々の塩基の化学的性質を変化させたりします。DNA損傷の後、DNA損傷応答（DDR）経路が活性化され、修復に関与するタンパク質がリクルートされます。損傷の種類を感知し、適切な修復反応を活性化するためには、多くの因子が関与しています。DDR因子を正しく活性化したり、リクルートしたりすることができないと、ゲノムの不安定性につながる可能性があり、これは癌を含む多くのヒト疾患の根底にあると考えられています。DDRタンパク質の研究は、遺伝毒性のある薬剤応答や薬剤耐性の細胞機構についての洞察を提供することができる。生体内でタンパク質を可視化する方法には、主に2つの方法がある。すなわち、関心のあるタンパク質に蛍光タンパク質をタグ付けしてライブイメージングで追跡する直接観察と、固定サンプル上で間接的に免疫蛍光を行う方法である。蛍光標識されたタンパク質を可視化することで、経時的に正確なモニタリングが可能になりますが、N末端またはC末端に直接タグを付けると、タンパク質の局在性や機能が阻害される可能性があります。そのため、修飾されていない内因性の状態でのタンパク質の観察が好ましい。ＤＮＡ修復タンパク質がＤＮＡインシュルトにリクルートされると、その濃度は局所的に増加し、それらはグループ、すなわち「病巣」を形成し、特異的な抗体を用いた間接免疫蛍光によって可視化することができる。タンパク質の病巣の検出は、直接的な相互作用の決定的な証明にはならないが、細胞内でのタンパク質の共局在化は、タンパク質が損傷部位に再集結していることを示しており、複合体形成に必要なイベントのシーケンスを知ることができる。あるタンパク質の野生型または変異型を発現する細胞における病巣の空間的重なりを注意深く解析することで、DNA修復機能に重要な機能ドメインに関する貴重な手がかりを得ることができる。最後に、タンパク質の共局在化は直接相互作用の可能性を示しており、細胞内での共免疫沈降法や精製タンパク質を用いた直接プルダウン法で検証することができる。

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance. There are two major ways of visualizing proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or "foci", that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies. Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.