様々な用量のLu-Nimotuzumabで治療した低EGFR発現A549と高EGFR発現A431腫瘍細胞における異なる細胞停止と分子応答の誘導

Induction of Different Cellular Arrest and Molecular Responses in Low EGFR Expressing A549 and High EGFR Expressing A431 Tumor Cells Treated with Various Doses of Lu-Nimotuzumab.

• ShishuKant Suman
• Rashmi Priya
• Mythili Kameswaran

抄録

ラジオ免疫療法（RIT）は、がん管理マルチモダリティにおける主要な抗がん治療である。Lu-NimotuzumabはEGFR発現腫瘍の放射免疫療法に使用されてきた。本研究では、低EGFR発現のA549腫瘍細胞と高EGFR発現のA431腫瘍細胞に対するLu-ニモツズマブの抗腫瘍効果の細胞・分子メカニズムの違いを理解することに焦点を当てている。Luで標識したニモツズマブをSE-HPLCで特徴付けた。A549およびA431細胞上に発現したEGFRに対するLu-ニモツズマブの特異性は、標識されていないニモツズマブの増加量を用いた競合アッセイによって確認された。異なる用量のLu-ニモツズマブに対するA549（低EGFR）およびA431（高EGFR）の細胞応答は、細胞生存能のためのViable countアッセイ、DNA染色による細胞周期解析、細胞死のためのアポトーシスアッセイ、および細胞増殖能のためのCFSE希釈アッセイによって決定された。形成されたDNA DSBの数は、PI染色を用いたγ-H2AXアッセイを用いて決定した。また、DNA損傷応答および修復（DRR）経路に関与する遺伝子の転写をRT-qPCRでモニターした。また、Lu-Nimotuzumabを用いた細胞結合競合試験では、A431細胞で34.3±1.7％、A549細胞で18.4±1.9％の特異的な結合を示したが、無標識Nimotuzumabとの共インキュベートにより減少した。細胞毒性とDNA損傷（DNA DSB）はLu-ニモツズマブの投与量の増加に伴って増加した。A549はG2/M停止を示したが、A431はG1停止を示した。アポトーシス死は逮捕されたA549およびA431細胞の死因の一つであり、Lu-Nimotuzumabの投与量の増加に伴って増加した。A431細胞では、Lu-Nimotuzumabの投与量が異なると増殖能の低下がCFSE染色で示された。A431およびA549のほとんどのDRR遺伝子の転写プロファイルは、4時間後に転写が減少し、16時間後に回復した。また、ほとんどのDRR遺伝子の転写の程度は、Lu-ニモツズマブの投与量にかかわらず、同様であった。本研究により、Lu-Nimotuzumabによる低EGFR発現腫瘍と高EGFR発現腫瘍を対象とした放射線免疫療法の統合的な新規治療戦略の開発が可能となり、治療効果が期待される。

Radioimmunotherapy (RIT) is a major anti-cancer therapy in cancer management multimodalities. Lu-Nimotuzumab has been in use for radioimmunotherapy of EGFR expressing tumors. This study focuses on understanding the differential cellular and molecular mechanisms of anti-tumor effects of Lu-Nimotuzumab on low EGFR expressing A549 and high EGFR expressing A431 tumor cells. Nimotuzumab labeled with Lu was characterized by SE-HPLC. Specificity of Lu-Nimotuzumab to EGFR expressed on A549 and A431 cells was confirmed by competitive assay using increasing amounts of unlabeled Nimotuzumab. Cellular responses of A549 (low EGFR) and A431 (high EGFR) in response to different doses of Lu-Nimotuzumab was determined by Viable count assay for cellular viability, cell cycle analysis by DNA staining, apoptotic assay for cell death and CFSE dilution assay for cellular proliferation capacity. Number of DNA DSBs formed was determined using γ-H2AX assay with PI staining. Transcription of genes involved in DNA damage response and repair (DRR) pathways were monitored by RT-qPCR.Lu-Nimotuzumab characterized by SE-HPLC exhibited radiochemical purity of 99.1 ± 0.6%. Cell binding competition studies with Lu-Nimotuzumab showed specific binding of 34.3 ± 1.7% with A431cells and 18.4 ± 1.9% with A549 cells which decreased when co-incubated with unlabeled Nimotuzumab. Cytotoxicity and DNA damage (DNA DSBs) increased with increase in dose of Lu-Nimotuzumab. A549 displayed G2/M arrest while A431 showed G1 arrest. Apoptotic death was determined to be one of the modes of death of arrested A549 and A431 cells which increases with the increase in dose of Lu-Nimotuzumab. Loss of proliferation capacity was higher in A431 showed by CFSE staining at different doses of Lu-Nimotuzumab. Transcription profile of most DRR genes in A431 and A549 showed decrease in transcription at 4 h followed by recovery at 16 h post treatment. Degree of transcription of most DRR genes was similar, irrespective of Lu-Nimotuzumab dose.Lu-Nimotuzumab induces different cellular arrest and molecular responses in low EGFR expressing A549 and high EGFR expressing A431 tumor cells. This study would enable development of integrative novel treatment strategies for radioimmunotherapy in low and high EGFR expressing tumors by Lu-Nimotuzumab with therapeutic gains.