熱応答性ポリマーをコーティングした新しいマイクロキャリア上で増殖したヒト間葉系幹細胞の回収

Recovery of human mesenchymal stem cells grown on novel microcarrier coated with thermoresponsive polymer.

• Yuki Narumi
• Ryosuke Iwai
• Mutsumi Takagi

抄録

マイクロキャリア（MC）上での細胞培養は、ヒト間葉系幹細胞（hMSCs）の大規模培養に有用な方法である。タンパク質分解酵素処理を行わずに、温度を下げることにより、MCからhMSCを採取するために、臨界溶液温度（LCST）が28〜32℃の範囲内にある双性イオン性・熱応答性を有する共重合体（CAT）で被覆したポリスチレンMCを開発し、CATとほぼ同じLCSTを有するポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（PNIPAM）で被覆したものと比較した。CAT共重合体を様々な密度でコーティングしたポリスチレンディッシュを用いた予備的な研究では、PNIPAMでコーティングしたものに比べて接着効率と細胞増殖に優れていたが、24℃まで温度を下げた場合の細胞回復率はいずれも約80％にとどまった。PNIPAM（0.64-16μg/cm）でコーティングしたポリスチレンMCとCAT（0.0050-1.0μg/cm）でコーティングしたポリスチレンMCでは細胞は成長したが、24℃での細胞回収率は20％以下であった。回収温度を24℃から4℃に下げると、CAT(0.010-0.10μg/cm)で被覆したMCでは約50%の細胞回収率が得られたが、PNIPAMで被覆したMCでは約20%の回収率に留まった。また、ポリスチレンMCを酸素プラズマ放電処理した後にCAT（0.20μg/cm）をコーティングした場合、4℃での細胞回収率は72％まで上昇した。このことから、酸素プラズマ放電処理とポリスチレンMCのCATコーティングを組み合わせることで、無処理のポリスチレンMCと同等の接着効率と増殖率が得られるだけでなく、70%以上の高い細胞回収率が得られる可能性があると考えられます。

The cultivation of cells on microcarriers (MCs) in stirred suspension system is useful method for the large-scale culture of human mesenchymal stem cells (hMSCs) for allogenic transplantation. To harvest hMSCs from MCs without using proteolytic enzyme treatment but by lowering temperature, polystyrene MCs coated with a copolymer called CAT having zwitterionic and thermoresponsive characteristics, which has a lower critical solution temperature (LCST) in the range of 28-32 ℃, were developed and compared with those coated with poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), which has an LCST almost the same as that of the CAT copolymer. A preliminary study using polystyrene dishes coated with the CAT copolymer at various densities showed superior adhesion efficiency and cell growth compared with those coated with PNIPAM; however, the rate of cell recovery by lowering the temperature to 24 ℃ was only about 80% in both cases. Although cells grew on polystyrene MCs coated with PNIPAM (0.64-16 µg/cm) and on those coated with CAT (0.0050-1.0 µg/cm), the cell recovery rate at 24 ℃ was lower than 20%. The decrease in recovery temperature from 24 to 4 ℃ resulted in about 50% cell recovery from CAT-coated (0.010-0.10 µg/cm) MC, whereas the rate of cell recovery from PNIPAM-coated MC remained at about 20%. CAT (0.20 µg/cm) coating after treatment of polystyrene MCs with oxygen plasma discharge increased the cell recovery rate to 72% at 4 ℃. Consequently, the combination of oxygen plasma discharge treatment and CAT coating of polystyrene MCs might provide not only adhesion efficiency and growth of MSCs comparable to those on polystyrene MCs without any treatment but also a high cell recover rate of more than 70%.