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月桂冠萎凋病病原体Raffaelea lauricolaの高効率形質転換と突然変異体スクリーニング
High efficiency transformation and mutant screening of the laurel wilt pathogen, Raffaelea lauricola.
PMID: 32656617 DOI: 10.1007/s00253-020-10762-1.
抄録
真菌病原体である Raffaelea lauricola は、ローレル萎凋病の原因菌であり、ローレル科の植物に影響を与える壊滅的な病気である。この真菌は、カミキリムシが特殊な構造体（ミカンギア）を持ち、木のギャラリーで成長するカブトムシの幼虫の共生体や食料源として作用することで媒介されます。月桂冠萎凋病菌の植物病原性と昆虫共生の分子基盤を解明するためには、効率的な形質転換プロトコルの確立を含めた分子ツールが必要である。その結果，R. lauricolaのホスフィノトリシン，クロリムロンエチル，ハイグロマイシン，ベノミルに対する感受性が明らかになった。barまたはsurマーカーのいずれかを用いたアグロバクテリウム媒介形質転換では、1-2-200形質転換体/10胞子が得られた。真菌芽胞の酢酸リチウム-ポリエチレングリコール（ＬｉＡｃ-ＰＥＧ）処理を用いた第２のプロトコールでは、５〜６０の形質転換体／μｇＤＮＡ／１０細胞が得られた。形質転換体は分裂的に安定であり（少なくとも5世代）、95％以上の形質転換体は単一の統合イベントを示した。緑および赤色蛍光タンパク質（EGFPおよびRFP）、ならびにグルクロニダーゼ（GUS）を発現するR. lauricola株を構築した。アグロバクテリウム媒介法を用いてランダムT-DNA挿入ライブラリーを構築し、遺伝学的スクリーニングにより、発生変異体、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）やフルコナゾール（フルコナゾール）に対する抵抗性を高める変異体、ビフェノールに対する感受性を低下させる変異体を分離した。これらの結果は、この真菌が示す共生性および病原性のライフスタイルの遺伝子解析に必要な R. lauricola の形質転換のための簡単で信頼性の高い遺伝子ツールを確立し、分子経路を解析するための様々な遺伝学的スクリーニングに使用できる挿入変異体のライブラリを確立した。このようにして、本研究では、この真菌が持つ共生性と病原性の生活様式を明らかにし、分子経路を解明するための様々な遺伝学的スクリーニングに利用できる挿入変異体ライブラリーを構築することを目指した。
The fungal pathogen, Raffaelea lauricola, is the causative agent of laurel wilt, a devastating disease affecting the Lauraceae family. The fungus is vectored by ambrosia beetles that carry the fungus in specialized structures (mycangia), with the fungus acting as a symbiont and food source for beetle larvae growing in tree galleries. In order to probe the molecular basis for plant pathogenicity and insect symbiosis of the laurel wilt fungus, molecular tools including establishment of efficient transformation protocols are required. Resistance marker profiling revealed susceptibility of R. lauricola to phosphinothricin, chlorimuron ethyl, hygromycin, and benomyl. Agrobacterium-mediated transformation using either the bar or sur marker resulted in 1-200 transformants/10 spores. A second protocol using lithium acetate-polyethylene glycol (LiAc-PEG) treatment of fungal blastospores yielded 5-60 transformants/μg DNA/10 cells. Transformants were mitotically stable (at least 5 generations), and > 95% of transformants showed a single integration event. R. lauricola strains expressing green and red fluorescent proteins (EGFP and RFP), as well as glucuronidase (GUS), were constructed. Using the Agrobacterium-mediated method, a random T-DNA insertion library was constructed, and genetic screens led to the isolation of developmental mutants as well as mutants displaying enhanced resistance to sodium dodecyl sulfate (SDS) or fluconazole, and those showing decreased susceptibility to biphenol. These results establish simple and reliable genetic tools for transformation of R. lauricola needed for genetic dissection of the symbiotic and virulent lifestyles exhibited by this fungus and establish a library of insertion mutants that can be used in various genetic screens to dissect molecular pathways. KEY POINTS: • Vectors and transformation protocols were developed for Raffaelea lauricola. • Method was used for construction of a random insertion mutant library. • Mutant library was validated by phenotypic screens for resistance and susceptibility to various agents.