ヘムオキシゲナーゼ1は、カドミウム曝露やAeromonas hydrophila感染による酸化ストレスに対するスワンプウナギの応答に重要な役割を果たしている

Heme oxygenase 1 plays a crucial role in swamp eel response to oxidative stress induced by cadmium exposure or Aeromonas hydrophila infection.

• Yuwei Zang
• Shuting Zheng
• Fang Tang
• Long Yang
• Xiping Wei
• Dan Kong
• Wenxiu Sun
• Wei Li

抄録

酸化ストレスは病理学的状態の開始と進行に大きく寄与している。細胞保護酵素であるヘムオキシゲナーゼ1（HO1）は、通常、生体内で酸化ストレスを緩和するためにアップレギュレーションされています。しかし、重金属曝露や病原性細菌感染による酸化ストレスへの応答におけるテレポストのHO1の機能は不明である。本研究では、スワンプウナギ（Monopterus albus）の肝臓からクローニングしたHO1様遺伝子の相補的DNAとゲノム配列を報告した。配列解析の結果、この遺伝子は保存されたヘムオキシゲナーゼのシグネチャを持ち、他のテレオスのHO1遺伝子との類似性が高いことが明らかになった。また、健康な組織と病原菌（Aeromonas hydrophila）や塩化カドミウム（CdCl）に曝露した組織でHO1の発現プロファイルを調べた。その結果、HO1 メッセンジャーRNA（mRNA）は肝臓で高発現し、他の組織では比較的低発現であることが明らかになった。A. hydrophilaの細菌感染により、肝臓、脾臓、腎臓でHO1のmRNA発現が有意に変化し、肝臓ではHO1とNrf2のmRNA発現がCdCl曝露後に上昇した。その後、ツバメウオHO1をpET28a発現ベクターにサブクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。組換え型HO1（rHO1）は、0.1mmol/l IPTGで誘導し、Ni-NTA His Bind Resin精製系で精製することに成功した。rHO1がin vitroでストレス耐性を付与できるかどうかを決定するために、CdClストレス下でのコントロールとHO1を発現する大腸菌の生存率をスポットアッセイによって比較した。rHO1タンパク質は、細菌宿主の生存率を有意に増加させた。rHO1の腹腔内注射がA. hydrophila誘導酸化ストレスからスワンプウナギの肝臓を保護したかどうかを評価するために、肝臓におけるHO1、Nrf2、ヘプチジンおよびIL-1βのmRNA発現、ならびに酸化ストレス関連パラメータ（ROSおよび総抗酸化能（T-AOC））を調べた。その結果、外因性のrHO1はHO1とヘプチジンのmRNA発現を有意に増加させ、ROSとT-AOCレベルを増加させることが示された。しかし、Nrf2およびIL-1βの発現レベルは、それぞれ有意にダウンレギュレートされ、アップレギュレートされた。これらの結果から、HO1は酸化ストレス応答の防御的役割を果たすだけでなく、その副作用についてもさらに検討が必要であることが示唆されました。

Oxidative stress contributes a lot to initiation and progression of pathological conditions. Heme oxygenase 1 (HO1), a cytoprotective enzyme, is usually upregulated to alleviate oxidative stress in vivo. The function of teleost HO1 in the response to oxidative stress induced by heavy metal exposure and in pathogenic bacterial infection remains uncertain. In the present study, both complementary DNA and genomic sequence of a HO1-like gene cloned from the liver of swamp eel (Monopterus albus) are reported. Sequence analysis showed that the putative amino acid sequence contained a conserved heme oxygenase signature and displayed higher similarity to HO1 genes of other teleosts. Expression profile of swamp eel HO1 was investigated in healthy tissues and in tissues following stimulation with pathogenic bacteria (Aeromonas hydrophila) or cadmium chloride (CdCl) exposure. Results demonstrated that HO1 messenger RNA (mRNA) was highly expressed in the liver and relatively less in other tissues. Bacterial infection with A. hydrophila significantly changed HO1 mRNA expression in the liver, spleen, and kidney, and the mRNA expression of HO1 and Nrf2 in the liver was elevated after the fish were exposed to CdCl. Subsequently, the swamp eel HO1 was subcloned into a pET28a expression vector and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). Recombinant HO1 (rHO1) was successfully induced by 0.1 mmol/l IPTG and purified by Ni-NTA His Bind Resin purification system. To determine whether the rHO1 could confer stress tolerance in vitro, the viability of control and HO1-expressing E. coli under CdCl stress was compared by spot assay. The rHO1 protein significantly increased survival rates of the bacterial hosts. To evaluate whether intraperitoneal injection with rHO1 protected the liver of swamp eel against A. hydrophila-induced oxidative stress, mRNA expression of HO1, Nrf2, hepcidin, and IL-1β as well as the oxidative stress-related parameters (ROS and total antioxidant capacity (T-AOC)) in the liver were examined. The results showed that exogenous rHO1 could significantly upgrade the mRNA expression of HO1 and hepcidin, coupled with increased ROS and T-AOC levels. However, Nrf2 and IL-1β expression levels were significantly downregulated and upregulated, respectively. These results suggested that HO1 should not only play a protective role in oxidative stress response and its adverse effects deserved further investigation.