クリプトコッカス菌の細胞内適応タンパク質Cin1に支配された細胞外RNAのトランスクリプトーム解析

Transcriptomic Analysis of Extracellular RNA Governed by the Endocytic Adaptor Protein Cin1 of .

• Muxing Liu
• Zhengguang Zhang
• Chen Ding
• Tuo Wang
• Ben Kelly
• Ping Wang

抄録

膜小胞は、ヒト真菌病原体の病原性に不可欠な莢膜成分とメラニン成分の分泌輸送を担うことから、病原性貨物と考えられている。しかし、膜小胞の他の成分や、真菌の生育や病原性に関わる機能については明らかにされていない。我々はこれまでに、クリプトコッカスのインターセクチンタンパク質Cin1が、細胞内輸送と病原性に必要なCin1-Wsp1-Cdc42内分泌経路を支配していることを発見している。RNA シーケンシングを用いて、マイクロRNA（miRNA）、小干渉RNA（siRNA）、ロングノンコーディングRNA（lncRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）を含む細胞外RNA（exRNA）のプロファイルを、クリプトコッカス菌の野生型（WT）株と由来のΔ変異株との間で比較した。WTからは７１２個のmiRNAが同定され、８８個のsiRNAが同定されたのに対し、Δからは７９９個のmiRNAが同定され、６６個のsiRNAが同定された。また、WTからは572個のlncRNAと7,721個のmRNAが、Δからは584個のlncRNAと7,703個のmRNAが同定された。差動発現解析の結果、その障害はexRNAの発現、輸送、機能など多くの重要な細胞変化をもたらすことが明らかになった。まず、miRNA標的遺伝子について、Gene Ontology（GO）とKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）のパスウェイエンリッチメント解析により、細胞内プロセス、構成要素、高分子機能が最も影響を受けるパスウェイであることが明らかになった。エンドサイトーシスの細胞内輸送に関与する遺伝子の数が多かった。第二に、異なる発現を示すlncRNA標的遺伝子とmRNA遺伝子のGO項とKEGG解析の結果は、miRNA標的遺伝子と一致していた。特に、タンパク質輸出はlncRNA標的遺伝子の中で最も影響を受けた経路であり、mRNA遺伝子の中では影響を受けた経路の一つであった。また、12のmRNAから得られた定量的リアルタイム逆転写PCR（qRT-PCR）の結果は、RNA-Seqの結果とほぼ一致しています。これらの研究により、我々の研究は、豊富なRNAを分泌し、Cin1がその分泌を調節する上で重要な役割を果たしていることを示す包括的な参照を提供する。exRNAの臨床的重要性が高まっていることを考えると、我々の研究は、新しい治療戦略の発見のために、この最先端技術をクリプトコッカス菌の病態研究に応用することの意義を明らかにしている。

Membrane vesicles are considered virulence cargoes as they carry capsular and melanin components whose secretory transport is critical for the virulence of the human fungal pathogen species. However, other components of the vesicles and their function in the growth and virulence of the fungus remain unclear. We have previously found that the cryptococcal intersectin protein Cin1 governs a unique Cin1-Wsp1-Cdc42 endocytic pathway required for intracellular transport and virulence. Using RNA sequencing, we compared the profiles of extracellular RNA (exRNA), including microRNA (miRNA), small interference RNA (siRNA), long noncoding RNA (lncRNA), and messenger RNA (mRNA) between the wild-type (WT), and derived Δ mutant strains of . Seven hundred twelve miRNAs and 88 siRNAs were identified from WT, whereas 799 miRNAs and 66 siRNAs were found in Δ. Also, 572 lncRNAs and 7,721 mRNAs were identified from WT and 584 lncRNAs and 7,703 mRNAs from Δ. Differential expression analysis revealed that the disruption of results in many important cellular changes, including those in exRNA expression, transport, and function. First, for miRNA target genes, Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis revealed that cellular processes, components, and macromolecular functions are the most affected pathways. A higher number of genes were involved in the intracellular transport of endocytosis. Second, the results of GO term and KEGG analysis of differentially expressed lncRNA target genes and mRNA genes were consistent with those of miRNA targets. In particular, protein export is the topmost affected pathway among lncRNA target genes and one of the affected pathways among mRNA genes. The result of quantitative real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) from 12 mRNAs tested is largely agreeable with that of RNA-Seq. Taken together, our studies provide a comprehensive reference that secretes abundant RNAs and that Cin1 plays a critical role in regulating their secretion. Given the growing clinical importance of exRNAs, our studies illuminate the significance of exploring this cutting-edge technology in studies of cryptococcal pathogenesis for the discovery of novel therapeutic strategies.

Copyright © 2020 Liu, Zhang, Ding, Wang, Kelly and Wang.