インド・コルカタ市の下痢便サンプルの腸内マイクロバイオームとレジストームをメタゲノム解析したところ、微生物暗黒物質のシグネチャーを含む中核的で可変性のあるマイクロバイオータが明らかになった

Metagenomic analysis of gut microbiome and resistome of diarrheal fecal samples from Kolkata, India, reveals the core and variable microbiota including signatures of microbial dark matter.

• Rituparna De
• Asish Kumar Mukhopadhyay
• Shanta Dutta

抄録

背景:

腸内マイクロバイオームとレジストームのメタゲノム解析は、下痢性疾患の発症と抗菌薬耐性菌の伝播（AMR）の動態を理解する上で有用である。コルカタからの下痢性糞便サンプル 20 個のメタゲノム配列決定を行い、コアと可変性のある腸内マイクロバイオータを理解した。これらのサンプルのうち 5 つをレジストーム解析に使用した。パイロット研究では、下痢性腸内のマイクロバイオータのシグネチャーと抗菌薬耐性遺伝子（ARG）の発生源を明らかにした。

Background: Metagenomic analysis of the gut microbiome and resistome is instrumental for understanding the dynamics of diarrheal pathogenesis and antimicrobial resistance transmission (AMR). Metagenomic sequencing of 20 diarrheal fecal samples from Kolkata was conducted to understand the core and variable gut microbiota. Five of these samples were used for resistome analysis. The pilot study was conducted to determine a microbiota signature and the source of antimicrobial resistance genes (ARGs) in the diarrheal gut.

結果:

16S rRNAアンプリコン配列決定は、Illumina MiSeqプラットフォームを用いて行い、MGnifyパイプラインを用いて分析した。細菌分類学的同定には、ゲノム分類学データベース（GTDB-Tk）を用いた。下痢性病因は培養法により決定した。Firmicutes、Bacteroidetes、ProteobacteriaおよびActinobacteriaは20サンプルに一貫して存在していた。また，Firmicutesは11検体で最も多く存在していた。バクテロイデテス／フィルミキュートスの比率は18サンプルで1以下であった。584属が観察された。そのうち18属は20サンプルすべてに存在していた。プロテオバクテリアは、ビブリオ・コレラエ感染に関連した6検体で支配的な菌種であった。すべての検体で分類学的単位（OTU）が保存されていることから、コアとなるマイクロバイオームの存在が示唆されました。また、コレラ菌やヘリコバクター・ピロリなどの病原体を無症状で保有していることが確認された。Candidate phyla（微生物暗黒物質）のシグネチャーが見られた。常在菌と病原体の細菌群の相対的な存在量に有意な相関が見られた。全ゲノムシークエンシング（WGS）をIllumina MiSeqシステム上で行い、metaSPAdes v3.9.1を用いて生のリードをアセンブルし、5サンプルのレジストームを調べた。ARG機能の付与にはABRicateを用いた。491の抵抗性決定因子が同定された。その結果，80％のサンプルでテトラサイクリン耐性が最も多い耐性決定因子であった．また，β-ラクタム系抗菌薬，アミノグリコシド系抗菌薬，キノロン系抗菌薬，マクロライド系抗菌薬に対するARGの割合が高かった。ARGの主な原因はEschericia sp.であった。

Results: 16S rRNA amplicon sequencing was performed using Illumina MiSeq platform and analysed using the MGnify pipeline. The Genome Taxonomy Database (GTDB-Tk) was used for bacterial taxonomic identification. Diarrheal etiology was determined by culture method. Phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria and Actinobacteria were consistently present in 20 samples. Firmicutes was the most abundant phylum in 11 samples. The Bacteroidetes/Firmicutes ratio was less than 1 in 18 samples. 584 genera were observed. 18 of these were present in all the 20 samples. Proteobacteria was the dominant phylum in 6 samples associated with Vibrio cholerae infection. Conservation of operational taxonomic units (OTUs) among all the samples indicated the existence of a core microbiome. Asymptomatic carriage of pathogens like Vibrio cholerae and Helicobacter pylori was found. Signature of Candidate phyla or "microbial dark matter" occurred. Significant correlation of relative abundance of bacterial families of commensals and pathogens were found. Whole-genome sequencing (WGS) on Illumina MiSeq system and assembly of raw reads using metaSPAdes v3.9.1 was performed to study the resistome of 5 samples. ABRicate was used to assign ARG function. 491 resistance determinants were identified. In 80% of the samples tetracycline resistance was the most abundant resistance determinant. High abundance of ARGs against β-lactams, aminoglycosides, quinolones and macrolides was found. Eschericia sp. was the major contributor of ARGs.

結論:

これは、異なる下痢性病原体に関連する腸内マイクロバイオームの最初の比較研究である。本研究は、急性下痢患者における中核的かつ可変的なマイクロバイオームを代表する異なる細菌分類群の初のカタログを提示するものである。この研究により、下痢に関連する腸内細菌叢のシグネチャの傾向を定義し、どのARGが豊富に存在し、AMRに寄与するメタゲノムアセンブルゲノム（MAG）がどのようなものかを明らかにした。

Conclusions: This is the first comparative study of the gut microbiome associated with different diarrheal pathogens. It presents the first catalogue of different bacterial taxa representing the core and variable microbiome in acute diarrheal patients. The study helped to define a trend in the gut microbiota signature associated with diarrhea and revealed which ARGs are abundantly present and the metagenome-assembled genomes (MAGs) contributing to AMR.

© The Author(s) 2020.