抽出および増幅ステップからのタクソンの出現は、マダニマイクロバイオータ解析におけるマルチプルコントロールの価値を実証しています

Taxon Appearance From Extraction and Amplification Steps Demonstrates the Value of Multiple Controls in Tick Microbiota Analysis.

• Emilie Lejal
• Agustín Estrada-Peña
• Maud Marsot
• Jean-François Cosson
• Olivier Rué
• Mahendra Mariadassou
• Cédric Midoux
• Muriel Vayssier-Taussat
• Thomas Pollet

抄録

背景:

ハイスループットシーケンス技術の開発により、細菌群集の多様性、構成、および機能の解析が大幅に改善された。過去10年以上にわたり、ハイスループットシーケンシングは、マダニ微生物群集の多様性と組成を同定するために広範囲に使用されてきた。しかし、DNA抽出から増幅までの分析プロセスのさまざまなステップに沿ってもたらされる汚染の影響について警告する研究が増えている。低バイオマスサンプル、例えば個々のマダニサンプルでは、これらの汚染物質が得られた配列の大部分を占める可能性があり、その結果、下流の分析や結果の解釈に大きな誤差を生じさせます。ダニの微生物相に関する研究のほとんどは、DNA抽出や増幅のステップにコントロールを含めることに言及していないか、電気泳動シグナルがないことを汚染の欠如とみなしている。このような観点から、我々はこれらのステップに起因する汚染配列の割合を評価することを目的とした。均質化、DNA 抽出、および DNA 増幅という、分析プロセス全体を通していくつかのカテゴリーのコントロールを含めることで、個々のダニの微生物相を分析しました。

Background: The development of high-throughput sequencing technologies has substantially improved analysis of bacterial community diversity, composition, and functions. Over the last decade, high-throughput sequencing has been used extensively to identify the diversity and composition of tick microbial communities. However, a growing number of studies are warning about the impact of contamination brought along the different steps of the analytical process, from DNA extraction to amplification. In low biomass samples, e.g., individual tick samples, these contaminants may represent a large part of the obtained sequences, and thus generate considerable errors in downstream analyses and in the interpretation of results. Most studies of tick microbiota either do not mention the inclusion of controls during the DNA extraction or amplification steps, or consider the lack of an electrophoresis signal as an absence of contamination. In this context, we aimed to assess the proportion of contaminant sequences resulting from these steps. We analyzed the microbiota of individual ticks by including several categories of controls throughout the analytical process: homogenization, DNA extraction, and DNA amplification.

結果:

コントロールにより、かなりの数の配列が得られた（コントロールのカテゴリーに応じて、平均配列は1,126～13,198個）。これらの対照から検出されたいくつかのオペレーショナルタクソノミックユニット（OTU）は、過去のマダニ微生物学研究で報告された属に属するものであった。本研究では、これらのOTUはサンプル中の総配列数の50.9％を占め、汚染物質と考えられた。ダニの幼虫の76.3％、オスの75％が50％以上の汚染を示したが、メス（65.7％）の汚染率は20％以下であった。汚染は主にホモジナイズと抽出試薬のコントロールで検出されたOTUに対応しており、これらのステップを慎重に管理することの重要性が強調されています。

Results: Controls yielded a significant number of sequences (1,126-13,198 mean sequences, depending on the control category). Some operational taxonomic units (OTUs) detected in these controls belong to genera reported in previous tick microbiota studies. In this study, these OTUs accounted for 50.9% of the total number of sequences in our samples, and were considered contaminants. Contamination levels (i.e., the percentage of sequences belonging to OTUs identified as contaminants) varied with tick instar and sex: 76.3% of nymphs and 75% of males demonstrated contamination over 50%, while most females (65.7%) had rates lower than 20%. Contamination mainly corresponded to OTUs detected in homogenization and extraction reagent controls, highlighting the importance of carefully controlling these steps.

結論:

ここで我々は、サンプルの実験室での処理工程に由来する汚染物質OTUが、シーケンスの実行における総配列収量の半分以上を占める可能性があり、マダニの微生物群集を特徴付ける際に信頼性の低い結果につながることを示した。このように、我々は、マダニの微生物相研究において、またより一般的には低バイオマスサンプルを含む研究において、ネガティブコントロールを日常的に使用することを強く推奨している。

Conclusion: Here, we showed that contaminant OTUs from sample laboratory processing steps can represent more than half the total sequence yield in sequencing runs, and lead to unreliable results when characterizing tick microbial communities. We thus strongly advise the routine use of negative controls in tick microbiota studies, and more generally in studies involving low biomass samples.

Copyright © 2020 Lejal, Estrada-Peña, Marsot, Cosson, Rué, Mariadassou, Midoux, Vayssier-Taussat and Pollet.