シトルリン化ヒストンの定量：ヒト血漿中のヌクレオソームH3Citを確実に定量するための改良されたアッセイ法の開発

Quantification of citrullinated histones: development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.

• Charlotte Thålin
• Katherina Aguilera
• Nathan W Hall
• Matthew R Marunde
• Jonathan M Burg
• Axel Rosell
• Maud Daleskog
• Maja Månsson
• Yohei Hisada
• Matthew J Meiners
• Zu-Wen Sun
• Matthew F Whelihan
• Marcus A Cheek
• Sarah A Howard
• Shruti Saxena-Beem
• Denis F Noubouossie
• Nigel S Key
• Saira Z Sheikh
• Michael-Christopher Keogh
• Martis W Cowles
• Staffan Lundström
• Nigel Mackman
• Håkan Wallén
• Andrea L Johnstone

抄録

背景:

最近のデータでは、好中球の細胞外トラップ（NET）のマーカーであるシトルリン化ヒストンH3（H3Cit）が、癌や血栓症などの病理学的状態での診断・予後診断能力を持つことが示唆されている。しかし、現在の研究は、標準化されたアッセイ法の欠如によって妨げられている。

BACKGROUND: Recent data propose a diagnostic and prognostic capacity for citrullinated histone H3 (H3Cit), a marker of neutrophil extracellular traps (NETs), in pathologic conditions such as cancer and thrombosis. However, current research is hampered by lack of standardized assays.

目的:

私たちは、ヒト血漿中のヌクレオソームH3Citを確実に定量するアッセイ法の開発を目指しました。

OBJECTIVES: We aimed to develop an assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.

方法:

酵素的に修飾されたヒストンH3をin vitroで校正標準として使用する一般的な方法と、利用可能なintrapeptidyl citrulline抗体の特異性を評価した。これらの知見に基づき、ヒト血漿中のヌクレオソームH3Citを定量するための新しいアッセイ法を開発し、検証した。

METHODS: We assessed the common practice of in vitro enzymatically modified histone H3 as calibration standards and the specificity of available intrapeptidyl citrulline antibodies. Based on our findings, we developed and validated a novel assay to quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.

結果:

我々は、酵素的にシトルリン化されたH3タンパク質が、血漿中の不安定性だけでなく、高い酵素依存性のロット変動によって損なわれていることを示しています。我々は、さらに、我々はさらに、明らかなヒストンH3のシトルリン化を含む半合成ヌクレオソームのパネルに対してテストしたときに報告されたターゲットに対する低い特異性を表示する intrapeptidyl citrullineに対する市販の抗体の大部分を実証しています。最後に、我々は、高特異性モノクローナル抗体とヒストンH3、アルギニン残基2、8および17（H3R2,8,17Cit）のアルギニンの代わりにシトルリンを含む半合成ヌクレオソームを校正標準として利用した新しいアッセイを提示します。このアッセイの厳密な検証により、ヒト血漿中のヌクレオソームH3Cit濃度を正確かつ確実に定量できることが示され、がん患者では健常者と比較して明らかに上昇しています。

RESULTS: We show that enzymatically citrullinated H3 proteins are compromised by high enzyme-dependent lot variability as well as instability in plasma. We furthermore demonstrate that the majority of commercially available antibodies against intrapeptidyl citrulline display poor specificity for their reported target when tested against a panel of semi-synthetic nucleosomes containing distinct histone H3 citrullinations. Finally, we present a novel assay utilizing highly specific monoclonal antibodies and semi-synthetic nucleosomes containing citrulline in place of arginine at histone H3, arginine residues 2, 8 and 17 (H3R2,8,17Cit) as calibration standards. Rigorous validation of this assay shows its capacity to accurately and reliably quantify nucleosomal H3Cit levels in human plasma with clear elevations in cancer patients compared to healthy individuals.

結論:

定義されたヌクレオソームコントロールを用いた新しいアプローチにより、ヒト血漿中のH3Citの信頼性の高い定量が可能となりました。この測定法は、疾患におけるヒストンのシトルリン化の役割やバイオマーカーとしての有用性を研究するために広く応用できると考えています。

CONCLUSIONS: Our novel approach using defined nucleosome controls enables reliable quantification of H3Cit in human plasma. This assay will be broadly applicable to study the role of histone citrullination in disease and its utility as a biomarker.

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