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Thermothelomyces thermophilus M77 由来の新規アリールアルコールオキシダーゼの酵素的汎用性と耐熱性
Enzymatic versatility and thermostability of a new aryl-alcohol oxidase from Thermothelomyces thermophilus M77.
PMID: 32653619 DOI: 10.1016/j.bbagen.2020.129681.
抄録
背景 真菌のアリールアルコール酸化酵素（AAOx）は、グルコース-メタノール-コリン酸化還元酵素ファミリーに属する細胞外フラボザイムであり、一次芳香族アルコールをアルデヒドおよび芳香族アルデヒドから対応する酸へと選択的に変換し、同時に副産物として過酸化水素（HO）を生成する役割を担っている。このHOは、バイオ燃料生産で探索されているバイオテクノロジーの特性であるリグニン分解経路に提供することができます。好熱性真菌Thermothelomyces thermophilus（旧Myceliophthora thermophila）では、エクソプロテオーム中にAAOxが1つだけ確認されている。方法 T. thermophilus の AAOx の 2.6Å分解能でのグリコシル化・非リフォールディング結晶構造を X 線結晶構造解析と小角 X 線散乱（SAXS）法を用いて解明した。さらに、酵素の基質特異性と耐熱性を明らかにするために生化学的解析を行った。結果 このフラボ酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素として持ち、芳香族基質や5-HMFを酸化することができる。また、シンナミルアルコールやベラトリルアルコールのようなかさばる芳香族基質や単純な芳香族基質に対しても同様の酸化速度を示すことがわかりました。さらに、MtAAOx の結晶構造から活性部位が開いていることが明らかになり、これが酵素の特異性を説明している可能性がある。結論 MtAAOx は、完全にアクセス可能な触媒トンネル、重グリコシル化、Ca 結合部位など、これまで知られていなかった構造的な違いを示しており、AA3_2 サブファミリーの酵素の耐熱性と活性を証明している。一般的な意義 MtAAOx の構造および生化学的解析は、アリールアルコールオキシダーゼの構造と機能の関係を理解する上で重要であり、将来のバイオテクノロジーへの応用に役立てるための追加的な分子ツールを提供するものと考えられる。
Background Fungal aryl-alcohol oxidases (AAOx) are extracellular flavoenzymes that belong to glucose-methanol-choline oxidoreductase family and are responsible for the selective conversion of primary aromatic alcohols into aldehydes and aromatic aldehydes to their corresponding acids, with concomitant production of hydrogen peroxide (HO) as by-product. The HO can be provided to lignin degradation pathway, a biotechnological property explored in biofuel production. In the thermophilic fungus Thermothelomyces thermophilus (formerly Myceliophthora thermophila), just one AAOx was identified in the exo-proteome. Methods The glycosylated and non-refolded crystal structure of an AAOx from T. thermophilus at 2.6 Å resolution was elucidated by X-ray crystallography combined with small-angle X-ray scattering (SAXS) studies. Moreover, biochemical analyses were carried out to shed light on enzyme substrate specificity and thermostability. Results This flavoenzyme harbors a flavin adenine dinucleotide as a cofactor and is able to oxidize aromatic substrates and 5-HMF. Our results also show that the enzyme has similar oxidation rates for bulky or simple aromatic substrates such as cinnamyl and veratryl alcohols. Moreover, the crystal structure of MtAAOx reveals an open active site, which might explain observed specificity of the enzyme. Conclusions MtAAOx shows previously undescribed structural differences such as a fully accessible catalytic tunnel, heavy glycosylation and Ca binding site providing evidences for thermostability and activity of the enzymes from AA3_2 subfamily. General significance Structural and biochemical analyses of MtAAOx could be important for comprehension of aryl-alcohol oxidases structure-function relationships and provide additional molecular tools to be used in future biotechnological applications.
Copyright © 2020. Published by Elsevier B.V.