ヒトインターフェロンγを発現する大腸菌細胞から得られた包接体中の核酸

Nucleic acids in inclusion bodies obtained from E. coli cells expressing human interferon-gamma.

• Elena Krachmarova
• Ivan Ivanov
• Genoveva Nacheva

抄録

背景:

包接体（IB）とは、目的の組換えタンパク質を主に含む組換え細菌細胞内のタンパク質凝集体のことである。ＩＢはタンパク質の集合体に加えて機能性タンパク質を含むことが示されているが、その不均一性や細菌由来の有害汚染物質の存在により、医薬品としての直接的な応用が妨げられている。したがって、可溶性種の生産とともに、IBは医療用途の組換えタンパク質の製造のための主要な供給源であり続けています。IBの品質と組成は、組換えタンパク質のリフォールディング収量とさらなる精製に影響を与えます。核酸が本物の成分なのか、IBの不純物が混入しているのかを知ることは、IBの形成を理解し、組換えタンパク質のリフォールディングと精製のための最適化されたプロトコルを開発するための前提条件となります。治療に応用可能なタンパク質であるヒトインターフェロンγ（hIFNγ）を過剰発現させた大腸菌から単離されたIBをモデルとして用いた。

BACKGROUND: Inclusion bodies (IBs) are protein aggregates in recombinant bacterial cells containing mainly the target recombinant protein. Although it has been shown that IBs contain functional proteins along with protein aggregates, their direct application as pharmaceuticals is hindered by their heterogeneity and hazardous contaminants with bacterial origin. Therefore, together with the production of soluble species, IBs remain the main source for manufacture of recombinant proteins with medical application. The quality and composition of the IBs affect the refolding yield and further purification of the recombinant protein. The knowledge whether nucleic acids are genuine components or concomitant impurities of the IBs is a prerequisite for the understanding of the IBs formation and for development of optimized protocols for recombinant protein refolding and purification. IBs isolated from Escherichia coli overexpressing human interferon-gamma (hIFNγ), a protein with therapeutic application, were used as a model.

結果:

IBは、標準的な条件下でhIFNγ発現プラスミドで形質転換した大腸菌LE392細胞から分離し、スクロースクッション上での遠心分離、超音波洗浄および非変性濃度の尿素での洗浄の数段階を経て、さらに精製した。精製の効率は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル電気泳動および残留無傷の細菌の存在のための平行微生物学的試験によって推定された。フェノール/クロロホルム抽出により、高度に精製されたIBはDNAとRNAの両方を含むことが示された。後者は、酵素処理とハイブリダイゼーションを組み合わせたUV分光法とアガロースゲル電気泳動によって調べた。DNAは主に250から1000bpの範囲の拡散画分として観察された。TRIzolで分離されたRNAもまた、かなりの分子的不均一性を示した。P標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、IBはrRNAを含み、hIFNγ mRNAが濃縮されていることが示された。

RESULTS: IBs were isolated from E. coli LE392 cells transformed with a hIFNγ expressing plasmid under standard conditions and further purified by centrifugation on a sucrose cushion, followed by several steps of sonication and washings with non-denaturing concentrations of urea. The efficiency of the purification was estimated by SDS-PAGE gel electrophoresis and parallel microbiological testing for the presence of residual intact bacteria. Phenol/chloroform extraction showed that the highly purified IBs contain both DNA and RNA. The latter were studied by UV spectroscopy and agarose gel electrophoresis combined with enzymatic treatment and hybridization. DNA was observed as a diffuse fraction mainly in the range of 250 to 1000 bp. RNA isolated by TRIzol also demonstrated a substantial molecular heterogeneity. Hybridization with P-labelled oligonucleotides showed that the IBs contain rRNA and are enriched of hIFNγ mRNA.

結論:

本研究で得られた結果は、核酸がIB中の不純物の共沈ではなく、本質的な成分である可能性を示唆しています。核酸は、微生物の細胞工場の転写・翻訳機構に由来する組換えタンパク質の凝集やIBの形成に積極的に関与していると考えられます。この考え方を確認するためには、さらなる研究が必要である。

CONCLUSIONS: The results presented in this study indicate that the nucleic acids might be intrinsic components rather than co-precipitated impurities in the IBs. We assume that the nucleic acids are active participants in the aggregation of recombinant proteins and formation of the IBs that originate from the transcription and translation machinery of the microbial cell factory. Further studies are needed to ascertain this notion.