軟骨前分化は骨膜由来のスフェロイドにおけるVEGFの血管新生効果を抑制する

Chondrogenic Pre-Differentiation Inhibits VEGF Angiogenic Effect in Pericranium-Derived Spheroids.

• Serban San-Marina
• Christopher Prummer
• Stephen Voss
• Danielle Hunter
• Benjamin Madden
• Mary Cristine Charlesworth
• Dale Ekbom
• Jeffrey R Janus

抄録

重要な骨欠損部の頭蓋顔面再建には、一般的に骨移植が必要です。移植片の利用可能性が疾患や併存疾患によって制限されることがあるため、組織工学的アプローチが積極的に模索されている。骨膜周囲は、新しい骨移植材を提供する可能性がある。発達と修復の間、骨は軟骨形成期に移行する。しかし、組織工学的な多能性細胞を用いれば、骨細胞に直接分化することができる。インビトロでの骨形成を再現する能力は、頭蓋骨周囲移植片の骨形成と血管形成に影響を与えるのか？これに答えるために、我々は事前に計画された開頭手術を受けた9人の患者から組織を採取し、骨膜由来のスフェロイドの3次元骨形成と血管新生を研究した。まず、Matrigel上で増殖・分化条件を設定した。各スフェロイドサンプルについて、a)連続的な骨形成分化（COD）、b)軟骨形成に先行した骨形成分化（CDOD）を調べた。VEGFの効果は、FGF、IL-1、IL-6、PDGF、TNF-αを添加したVEGFと比較しました。この限られたサンプルでは、細胞増殖に年齢や性差は見られませんでした。同様に、CODスフェロイドとCDODスフェロイドの間には、通常の培地を用いた場合と比較して、骨原性または血管原性スコアに統計的に有意な差は認められなかった。しかし、CODではVEGFは対照培地と比較して血管新生を統計的に有意に増加させた（p=0.007）。また、CODではVEGFとVEGF+GFMの両方が骨形成を増加させた（それぞれp=0.047、p=0.038）。対照的に、CDODでは、VEGFもVEGF+GFMも対照培地と比較して統計的に有意な血管新生・骨形成スコアを示さなかった。これらの結果を理解するために、我々はナノ液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法（nLC-MS/MS）を併用してスフェロイドタンパク質の発現を特徴付けた。a) 内皮マーカーJUP、PTGIS、PTGS2、およびTYMP、b) 組織リモデリング因子CHI3L1およびMMP14、およびc) 代謝経路調節因子ANGPTL4、ITGA5およびWNT5Aであった。ANGPTL4、ITGA5、PTGIS、PTGS2、WNT5Aは保存された血管新生ネットワークを定義し、VEGF+GFMと比較してVEGFで2倍以上増加した。最後に、我々は、個別化された移植のための印刷可能なポリ（プロピレンフマル酸塩）（PPF）足場上での骨形成を調べた。COD+VEGF条件下では、PDCを充填したPPF足場は海綿状の骨形成の特徴を示した。このことから、ヒトの頭蓋骨周囲は、組織印刷を用いた頭蓋顔面骨修復への応用により、骨を生成する細胞の潜在的な貯蔵庫となる可能性がある。

Craniofacial reconstruction of critical bone defects typically requires a bone graft. As graft availability may be restricted by disease or co-morbidities, tissue engineering approaches are actively sought. The pericranium could provide new bone graft material. During development and repair, bone transitions through a chondrogenic phase. However, with tissue engineering pluripotent cells can differentiation directly into bone cells. Does ability to recapitulate bone formation in vitro affect osteogenesis and vascularization of pericranium grafts? To answer this, we obtained tissue from nine patients with pre-planned craniotomy surgery and studied 3D osteogenesis and angiogenesis of pericranium-derived spheroids. First, we established growth and differentiation conditions on Matrigel. For each spheroid sample we investigated a) continuous osteogenic differentiation (COD), and b) osteogenic differentiation preceded by chondrogenesis (CDOD). The effect of VEGF was compared to VEGF supplemented with FGF, IL-1, IL-6, PDGF, and TNF-α, a growth factor mix (GFM) with possible synergistic effects. In this limited sample we observed no age or sex-related differences in cell expansion. Similarly, no statistically significant differences in osteogenic or angiogenic scores between COD or CDOD spheroids were noted with regular media. In COD however, VEGF statistically significantly increased angiogenesis compared to control media (p=0.007)). Also in COD, both VEGF and VEGF+GFM increased osteogenesis (p=0.047 and p=0.038, respectively). By contrast, in CDOD neither VEGF nor VEGF+GFM yielded statistically significant angiogenesis or osteogenesis scores compared to control media. To understand these results we characterized spheroid protein expression by nano-liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (nLC-MS/MS). Nine angiogenic proteins were either uniquely expressed or upregulated in COD compared to CDOD: a) endothelial markers JUP, PTGIS, PTGS2, and TYMP, b) tissue remodeling factors CHI3L1 and MMP14, and c) metabolic pathways modulators ANGPTL4, ITGA5, and WNT5A. ANGPTL4, ITGA5, PTGIS, PTGS2, WNT5A define a conserved angiogenic network and were >2 fold increased in VEGF compared to VEGF+GFM. Finally, we examined bone formation on printable poly-(propylene-fumarate) (PPF) scaffolds for individualized grafting. Under COD+VEGF conditions, PPF scaffolds loaded with PDCs displayed hallmarks of spongiform-like bone formation. Thus, the human pericranium may be a potential repository for bone-generating cells with applications in craniofacial bone repair using tissue printing.