A3A-PBE塩基編集システムを用いたアロテトラプロイドナタネにおける高効率な塩基編集

Base editing with high efficiency in allotetraploid oilseed rape by A3A-PBE base editing system.

• Hongtao Cheng
• Mengyu Hao
• Bingli Ding
• Desheng Mei
• Wenxiang Wang
• Hui Wang
• Rijin Zhou
• Jia Liu
• Chao Li
• Qiong Hu

抄録

CRISPR/Cas-塩基編集は、標的部位でヌクレオチドを別の型に変換することができる新しい技術である。本研究では、ヒト A3A シチジンデアミナーゼと Cas9 ニカーゼ、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤を融合させた A3A-PBE システムを構築し、アロテトラプロイド Brassica napus を用いて開発した。ALS、RGA、IAA7遺伝子を標的とした3種類のsgRNAをそれぞれ設計した。その結果、3つの標的遺伝子のすべてにおいて、塩基編集効率は20%以上であることが示された。ターゲットの配列決定の結果、編集ウィンドウはPAM配列のC1からC10の範囲であることが明らかになった。また、塩基編集されたALSの植物は高い除草剤抵抗性を示したが、RGAやIAA7の植物は株高が低下していた。すべての塩基編集はT世代からT世代に遺伝することができた。また、3種のsgRNAの全ての標的部位にいくつかのインデル変異が確認された。さらに、ほとんどの標的部位では C から T への置換は検出されなかったが、塩基編集された植物と野生型の植物の間では、全ゲノムシークエンシングにより大規模な SNP の変異が確認された。これらの結果から、A3A-PBE塩基編集システムは、ナタネにおいて高い編集効率でCからTへの置換を効果的に変換し、編集窓を広げることが可能であることが明らかになった。また、ALS、IAA7、RGA遺伝子の変異体は、雑草防除のための除草剤耐性を付与したり、機械的な収穫に適した植物構造を持つようになる可能性がある。

CRISPR/Cas- base editing is an emerging technology that could convert a nucleotide to another type at the target site. In this study, A3A-PBE system consisting of human A3A cytidine deaminase fused with a Cas9 nickase and uracil glycosylase inhibitor, was established and developed in allotetraploid Brassica napus. We designed three sgRNAs to target ALS, RGA and IAA7 genes, respectively. Base editing efficiency was demonstrated to be more than 20% for all of the three target genes. Target sequencing results revealed that the editing window ranged from C1 to C10 of the PAM sequence. Base edited plants of ALS conferred high herbicide resistance, while base edited plants of RGA or IAA7 exhibited decreased plant height. All the base editing could be genetically inherited from T to T generation. Several Indel mutations were confirmed at the target sites for all the three sgRNAs. Furthermore, though no C to T substitution was detected at the most potential off target sites, large scale SNP variations were determined through whole genome sequencing between some base edited and wild type plants. These results revealed that A3A-PBE base editing system could effectively convert C to T substitution with high editing efficiency and broadened editing window in oilseed rape. Mutants for ALS, IAA7 and RGA genes could be potentially applied to confer herbicide resistance for weed control or with better plant architecture suitable for mechanic harvesting.

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