MARCKS-Like Protein-1(MLP-1)は腎遠位複雑管細胞のENAC活性を制御している

MARCKS-Like Protein-1(MLP-1) regulates ENaC Activity in Renal Distal Convoluted Tubule Cells.

• Chang Song
• Qiang Yue
• Auriel Moseley
• Otor Al-Khalili
• Brandi M Wynne
• Heping Ma
• Lihua Wang
• Douglas C Eaton

抄録

ENaCのゲーティングはホスファチジルイノシトール4,5-ビスフォスフェート(PIP)によって制御されている。ENaCのPIP依存的な制御は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼC基質様プロテイン-1（MLP-1）によって媒介されている。MLP-1は細胞膜でPIPと結合している。我々は、MLP-1がDCT-15細胞のENACを制御しているかどうかを調べた。MLP-1は、PIPを隔離する正に荷電したエフェクタードメインと、PKCの標的となりMLP-1の膜結合を制御するセリンを含むドメイン、膜結合を促進するミリストイル化ドメイン、機能未知の多重相同性2ドメインから構成されている。いくつかのMLP-1変異体を構築した。WT：全長野生型タンパク質；S3A：リン酸化を防ぐためのエフェクタードメインの3つの置換；S3D：構成的リン酸化を模倣するために3つのセリンをアスパラギン酸塩に置換；GA：ミリストイル化部位のグリシンをアラニンに置換し、GAがミリストイル化されないようにした。変異体は、N末端3XFLAGまたはC末端m-CherryまたはV5でタグ付けされた。MLP変異体へのトランスフェクションは、ENaC活性を改変した。S3A活性が最も高く、S3D活性が最も低かった；両者の活性はWTと有意に異なっていた。ウェスタンブロットでは、3XFLAGタグ付きMLP-1変異体をトランスフェクションした場合、52 KDaの全長MLP-1の発現は、S3A-MLP-1トランスフェクションした細胞で増加し、S3D-MLP-1トランスフェクションした細胞で減少した。低分子量バンドは、潜在的なプロテアーゼ切断産物に対応するものとして検出された。共焦点イメージングは、突然変異体が、膜または細胞質内の好ましい位置と一致する異なる細胞内区画に局在していることを示している。プロテインキナーゼCは内因性MLP-1のリン酸化を増加させ、ENAC活性を低下させる。我々の結果は、ENaCのMLP-1の制御におけるタンパク質分解処理のための複雑な役割を示唆している。

ENaC gating is regulated by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP). The PIP-dependent regulation of ENaC is mediated by the myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate-like protein-1 (MLP-1). MLP-1 binds to PIP at the plasma membrane. We examined MLP-1 regulation of ENaC in DCT-15 cells. MLP-1 consists of a positively charged effector domain that sequesters PIP and contains serines that are a PKC targets and controls MLP-1 membrane association; a myristoylation domain promoting membrane association, and a multiple homology 2 domain of unknown function. We constructed several MLP-1 mutants: WT: a full length wild-type protein; S3A: 3 substitutions in the effector domain to prevent phosphorylation; S3D: replaced three serines with aspartates to mimic constitutive phosphorylation; GA: replaced the myristoylation site glycine with alanine so GA could not be myristoylated. Mutants were tagged with N-terminal 3XFLAG or C-terminal m-Cherry or V5. Transfection with MLP mutants modified ENaC activity: S3A activity was highest and S3D lowest; the activity of both was significantly different from WT. In Western blots, when transfected with 3XFLAG tagged MLP-1 mutants, expression of full length MLP-1 at 52 KDa increased in S3A-MLP-1 transfected cells and decreased in S3D-MLP-1 transfected cells. Lower molecular weight bands were detected that correspond to potential protease cleavage products. Confocal imaging shows that mutants localize in different sub-cellular compartments consistent with their preferred location in the membrane or cytosol. Protein kinase C increases phosphorylation of endogenous MLP-1 and reduces ENaC activity. Our results suggest a complicated role for proteolytic processing in MLP-1 regulation of ENaC.