乳牛の不顕性乳腺感染症の早期発見のための高感度で迅速なラテラルフローアッセイ

Sensitive and rapid lateral-flow assay for early detection of subclinical mammary infection in dairy cows.

• Mohanned Naif Alhussien
• Ajay Kumar Dang

抄録

不顕性乳房炎（SCM）を初期段階で検出することで、経済的損失を大幅に削減し、乳質と動物福祉を向上させることができます。我々は、乳牛の好中球のミエロペルオキシダーゼ（MPO）酵素を標的とした乳牛のSCM検出のための半定量的ラテラルフローアッセイを開発した。競合性のあるイムノアッセイ法を用い、コロイダル金ナノ粒子（GNP）を調製し、標識剤として使用した。モノクローナル抗MPO抗体を使用し、その品質を酵素結合免疫吸着アッセイおよびドットブロットで評価した。ＧＮＰ抗体と抗ＭＰＯ抗体の共役化方法を標準化し、コンジュゲートパッドの上にコンジュゲートを置いた。MPOとキャリアタンパク質（OVA）を結合させたMPOと種特異的二次抗体をそれぞれテストラインとコントロールラインに配置した。開発したアッセイは、健常牛、SCM 牛、臨床乳房炎牛から採取した 75 匹の生乳サンプルを用いて検証しました。その結果、MPO は 1.5ng/ml と低く、97％以上の精度で検出でき、他の乳タンパク質とのクロスチェックでは交差反応性は認められなかった。開発した測定法は、乳中SCCの溶解液を得るための実験室がある場合のSCM診断検査の代替法として使用することができます。

Detection of subclinical mastitis (SCM) in its initial stage can save great economic losses, improve milk quality and animal welfare. We have developed a semiquantitative lateral flow assay for the detection of SCM in dairy cows targeting myeloperoxidase (MPO) enzyme of milk neutrophils. A competitive immunoassay format was used, and colloidal gold nanoparticles (GNP) were prepared and used as a labelling agent. Monoclonal anti-MPO antibodies were used and assessed for its quality by enzyme-linked immunosorbent assay and dot blot. Conjugation method for GNP and anti-MPO antibodies was standardised, and the conjugate was placed over the conjugate pad. MPO coupled with a carrier protein (OVA) and the species-specific secondary antibodies were placed on test and control lines, respectively. The developed assay was verified with 75 milk samples collected from healthy, SCM and clinical mastitis cows. It displayed a high sensitivity as it could detect MPO as low as 1.5 ng/ml, an accuracy greater than 97% and showed no crossreactivity when crosschecked with other milk proteins. The developed assay can be used as an alternative for SCM diagnostic tests where lab structure are available for obtaining the lysate of milk SCC.