後腹膜脂肪肉腫の進行促進因子としてのTYMSの同定。バイオインフォマティクス解析と生物学的エビデンス

Identification of TYMS as a promoting factor of retroperitoneal liposarcoma progression: Bioinformatics analysis and biological evidence.

• Sha Zhang
• Liang Yan
• Can Cui
• Zhen Wang
• Jianhui Wu
• Min Zhao
• Bin Dong
• Xiaoya Guan
• Xiuyun Tian
• Chunyi Hao

抄録

後腹膜脂肪肉腫（RLPS）は、最も一般的なタイプの後腹膜肉腫の一つであり、高い再発率を有する。その病態をさらに解明し、より効果的な治療法を開発することが急務である。本研究の目的は、バイオインフォマティクス解析と分子生物学を用いてRLPSの潜在的なドライバー遺伝子を同定し、RLPS治療のためのさらなる解析に適した潜在的なターゲットを明らかにすることである。バイオインフォマティクス解析により、マイクロアレイデータをもとに脂肪肉腫組織と正常脂肪組織との間で発現が異なる遺伝子（DEG）を同定し、その中からチミジル酸合成酵素（TYMS）を高含量スクリーニング（HCS）に基づいて選択した。TYMSの発現はRLPS腫瘍組織および細胞株で評価した。逆転写定量PCRにはRLPS組織21種とNF凍結組織10種の合計21種を使用し、免疫組織化学的解析には47種のRLPSホルマリン固定標本を使用した。TYMSダウンレギュレーションが細胞増殖、アポトーシス、細胞周期進行、細胞移動、浸潤に及ぼす影響をレンチウイルスを介したshort hairpin RNAを用いて評価した。また、RLPSにおけるTYMSの発現機構をタンパク質マイクロアレイを用いて調べ、ウエスタンブロット法で検証した。その結果、855個のDEGが同定された。HCSの結果から、TYMSのノックダウンはRLPS細胞の増殖能に最も顕著な効果を示した。TYMSのmRNA発現レベルは、NF組織と比較してRLPS組織で高かった（P<0.001）。TYMS発現量は、低悪性度RLPS組織と比較して高悪性度RLPS組織で高かった（P=0.003）。TYMSの発現が陽性の患者では、発現が陰性の患者に比べて全生存期間（OS）および無病生存期間（DFS）が悪化した（OS, P=0.024、DFS, P=0.030）。TYMSのノックダウンは、RLPS細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを促進し、G1期からS期への細胞周期の進行を促進し、RLPS細胞の細胞移動と浸潤を減少させた。また、タンパク質マイクロアレイ解析およびウエスタンブロット法により、TYMSノックダウンによりJanus Kinase/Signal transducersおよびActivators of transcription pathwayがダウンレギュレーションされることが示された。結論として、TYMSの発現はRLPS組織においてアップレギュレーションされ、TYMSのダウンレギュレーションはRLPSの進行を抑制することが示された。

Retroperitoneal liposarcoma (RLPS) is one of the most common types of retroperitoneal sarcomas, and has a high recurrence rate. There is an urgent need to further explore its pathogenesis and develop more effective treatment strategies. The aim of the present study was to identify potential driver genes of RLPS through bioinformatics analysis and molecular biology to elucidate potential targets that are suitable for further analysis for the treatment of RLPS. Differentially expressed genes (DEGs) between liposarcoma and normal fatty (NF) tissues were identified based on microarray data through bioinformatics analysis, and thymidylate synthase (TYMS) was selected from the DEGs, based on high content screening (HCS). TYMS expression was evaluated in RLPS tumor tissues and cell lines. A total of 21 RLPS tissues and 10 NF frozen tissues were used for reverse transcription‑quantitative PCR, and 47 RLPS formalin‑fixed specimens were used for immunohistochemical analysis. The effect of TYMS downregulation on cell proliferation, apoptosis, cell cycle progression, and cell migration and invasion were evaluated using lentivirus‑mediated short hairpin RNA. The underlying mechanisms of TYMS in RLPS were examined by protein microarray and verified by western blotting. A total of 855 DEGs were identified. TYMS knockdown had the most notable effect on the proliferative capacity of RLPS cells according to the HCS results. TYMS mRNA expression levels were higher in RLPS tissues compared with NF tissues (P<0.001). TYMS expression was higher in high‑grade RLPS tissues compared with low‑grade RLPS tissues (P=0.003). The patients with positive TYMS expression had a worse overall survival (OS) and disease‑free survival (DFS) compared with the patients with negative TYMS expression (OS, P=0.024; DFS, P=0.030). The knockdown of TYMS reduced proliferation, promoted apoptosis, facilitated cell cycle progression from G1 to S phase, and reduced cell migration and invasion of RLPS cells. Protein microarray analysis and western blotting showed that the Janus Kinase/Signal transducers and activators of transcription pathway was downregulated following TYMS knockdown. In conclusion, TYMS expression is upregulated in RLPS tissues, and downregulation of TYMS reduces RLPS progression.