ファルネシルピロリン酸合成酵素と-セドロール合成酵素の融合発現による-セドロール生産の促進

Enhancing -cedrol production in by fusion expression of farnesyl pyrophosphate synthase and -cedrol synthase.

• Govinda R Navale
• Poojadevi Sharma
• Madhukar S Said
• Sudha Ramkumar
• Mahesh S Dharne
• H V Thulasiram
• Sandip S Shinde

抄録

テルペン合成酵素は、非環状二リン酸ファルネシル二リン酸を触媒して目的のセスキテルペンに変換する。本研究では、ファルネシルピロリン酸合成酵素（ ）とテルペン合成酵素および-セドロール合成酵素（ ）を個別に連結して融合酵素を構築した。この融合酵素のN末端の停止コドンを除去し、短いペプチド(GSGGS)で置換し、2つのオープンリーディングフレーム間にリンカーを導入した。この融合クローンをロセタDE3細胞で発現させた。融合酵素は、基質であるイソペンテニルピロリン酸およびジメチルアリルピロリン酸から、逐次反応によりセスキテルペン８--セドロールを生成した。イソペンチル二リン酸の値は4.71μMであった。融合酵素は、単独の酵素と比較して、また、酵素アッセイで時間をかけて組み合わせた場合にも、効率的にIPPを-セドロールに変換することができた。さらに、融合プラスミドを保有する組換えBL21株は、発酵培地中での-セドロールの生産に成功した。融合プラスミドを保有する株（pET32a-FPPS-ECS）では1.084±0.09mg/Lの-セドロールが、混合プラスミドを保有する株（pRSETB-FPPS、pET28a-ECS）では過剰発現とMEP経路の利用により1.002±0.07mg/Lの発酵培地中での-セドロールの産生に成功した。構造解析は I-TASSER サーバーを用いて行い、AutoDock Vina ソフトウェアを用いてドッキングを行った結果、N-C 末端ドメインの二次構造と融合酵素の機能ドメインとの相対的な位置関係が、個々の酵素よりも融合酵素複合体の触媒特性に大きく影響することが示唆された。

Terpene synthase catalyses acyclic diphosphate farnesyl diphosphate into desired sesquiterpenes. In this study, a fusion enzyme was constructed by linking farnesyl pyrophosphate synthase () individually with terpene synthase and -cedrol synthase (). The stop codon at the N-terminus of was removed and replaced by a short peptide (GSGGS) to introduce a linker between the two open reading frames. This fusion clone was expressed in Rosseta DE3 cells. The fusion enzyme produced sesquiterpene 8--cedrol from substrates isopentenyl pyrophosphate and dimethylallyl pyrophosphate through sequential reactions. The values for for isopentyl diphosphate was 4.71 µM. The fusion enzyme carried out the efficient conversion of IPP to -cedrol, in comparison to single enzymes and when combined together in enzyme assay over time. Further, the recombinant BL21 strain harbouring fusion plasmid successfully produced -cedrol in fermentation medium. The strain having fusion plasmid (pET32a-FPPS-ECS) produced 1.084 ± 0.09 mg/L -cedrol, while the strain harbouring mixed plasmid (pRSETB-FPPS and pET28a-ECS) showed 1.002 ± 0.07 mg/L titre in fermentation medium by overexpression and MEP pathway utilization. Structural analysis was done by I-TASSER server and docking was done by AutoDock Vina software, which suggested that secondary structure of the N- C terminal domain and their relative positions to functional domains of the fusion enzyme was greatly significant to the catalytic properties of the fusion enzymatic complex than individual enzymes.

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