TGF-β1発現のためのCHO細胞の高細胞密度一過性トランスフェクション

High cell density transient transfection of CHO cells for TGF-β1 expression.

• Abdalla A Elshereef
• André Jochums
• Antonina Lavrentieva
• Lena Stuckenberg
• Thomas Scheper
• Dörte Solle

抄録

ポリエチレンイミン（PEI）を用いた一過性トランスフェクションのための高細胞密度は、組換えタンパク質の迅速かつ最大生産のために使用することができる。高細胞密度は、バッチまたは灌流系などの異なる培養系によって得ることができる。ここでは、トランスフェクション評価のために遠心分離を行うことにより、最大1,800万細胞/mLの細胞密度を得ることができた。PEIのトランスフェクション効率は、エンハンストグリーン蛍光タンパク質（EGFP）レポータープラスミドDNA（pDNA）をトランスフェクションすることにより容易に決定された。蛍光強度とトランスフェクション効率の間には直線的な相関関係が改善されていた。PEIのトランスフェクション効率は、トランスフェクション条件に大きく依存し、組換えタンパク質のレベルに直接関係していた。一過性のトランスフェクションプロセスを最適化するためには、いくつかの要因が必要であり、これらの要因には、培地の種類（低密度または高密度のトランスフェクションに適合する）、前培養CHO-K1懸濁液の細胞密度、およびPEIに対するpDNAのレベルが含まれていた。実験計画法（DoE）解析の結果、CHOMACS CD培地を用いた 10×10cells/mL の最適なトランスフェクション条件では、トランスフェクション効率 73％、細胞生存率 80％以上を達成した。これらの結果は、シェイクフラスコを用いた形質転換増殖因子β1（TGF-β1）の産生についても確認された。60mL上清からの精製TGF-β1タンパク質濃度は27μg/mLであり、生物学的に活性なタンパク質であった。

High cell densities for transient transfection with polyethyleneimine (PEI) can be used for rapid and maximal production of recombinant proteins. High cell densities can be obtained by different cultivation systems, such as batch or perfusion systems. Herein, densities up to 18 million cells/mL were obtained by centrifugation for transfection evaluation. PEI transfection efficiency was easily determined by transfected enhanced green fluorescence protein (EGFP) reporter plasmid DNA (pDNA). A linear correlation between fluorescence intensity and transfection efficiency was improved. The transfection efficiency of PEI was highly dependent on the transfection conditions and directly related to the level of recombinant protein. Several factors were required to optimize the transient transfection process; these factors included the media type (which is compatible with low or high cell density transfection), the preculture CHO-K1 suspension cell density, and the pDNA to PEI level. Based on design of experiment (DoE) analyses, the optimal transfection conditions for 10 × 10 cells/mL in the CHOMACS CD medium achieved 73% transfection efficiency and a cell viability of over 80%. These results were confirmed for the production of transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) in a shake flask. The purified TGF-β1 protein concentration from 60 mL supernatant was 27 µg/mL, and the protein was biologically active.

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