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Brucella FtrAにおける保存されたCu結合残基のコンフォメーション安定性と機能性の発現における役割を調べる
Investigating the roles of the conserved Cu-binding residues on Brucella FtrA in producing conformational stability and functionality.
PMID: 32623149 DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2020.111162.
抄録
ブルセラ菌はその生存に鉄を必要とする人獣共通感染性病原体であり、いくつかの高親和性取り込み系を発現することで鉄を獲得している。その中で、新たに発見された第一鉄トランスポーターFtrABCDは、第一鉄の取り込みに関与していることが提案されています。その結果、提案されているペリプラズム鉄結合成分であるFtrAは、P19型タンパク質（銅依存性鉄親和性を示すC. jejuni由来のペリプラズムタンパク質）であることが、配列相同性から明らかになった。他のP19系に関する以前の構造および生化学的研究では、Cu依存性Mn親和性が確立されており、これらの系のホモダイマーが形成されている。これらのタンパク質からのCu配位アミノ酸は、Brucella FtrAに保存されており、類似の特性を示唆している。しかし、これまでのところ、金属親和性や二量体形成の可能性を示す実験的証拠はありませんでした。我々は、野生型FtrAとCu結合変異体（H65A, E67A, H118A, H151A）を用いて、このP19型タンパク質の金属親和性、フォールディング安定性、二量体形成能、Cu依存性の分子基盤について、ホモロジーモデリング、分析的ゲルろ過、熱量測定、分光学的手法を用いて検討した。今回報告されたデータは、野生型FtrAのCu依存性、低μM Mn（Fe擬態）親和性を確認したものである。また、保存されているCu結合残基を変異させた結果、Mn親和性が失われ、安定性の低いタンパク質構造が形成されることも明らかになった。
Brucella is a zoonotic pathogen requiring iron for its survival and acquires this metal through the expression of several high-affinity uptake systems. Of these, the newly discovered ferrous iron transporter, FtrABCD, is proposed to take part in ferrous iron uptake. Sequence homology shows that, FtrA, the proposed periplasmic ferrous-binding component, is a P19-type protein (a periplasmic protein from C. jejuni which shows Cu dependent iron affinity). Previous structural and biochemical studies on other P19 systems have established a Cu dependent Mn affinity as well as formation of homodimers for these systems. The Cu coordinating amino acids from these proteins are conserved in Brucella FtrA, hinting towards similar properties. However, there has been no experimental evidence, till date, establishing metal affinities and the possibility of dimer formation by Brucella FtrA. Using wild-type FtrA and Cu-binding mutants (H65A, E67A, H118A, and H151A) we investigated the metal affinities, folding stabilities, dimer forming abilities, and the molecular basis of the Cu dependence for this P19-type protein employing homology modeling, analytical gel filtration, calorimetric, and spectroscopic methods. The data reported here confirm a Cu-dependent, low-μM Mn (Fe mimic) affinity for the wild-type FtrA. In addition, our data clearly show the loss of Mn affinity, and the formation of less stable protein conformations as a result of mutating these conserved Cu-binding residues, indicating the important roles these residues play in producing a native and functional fold of Brucella FtrA.
Published by Elsevier Inc.