核細孔複合体コア内部のナノバイオフィラメントの時空間追跡

Spatiotemporally tracking of nano-biofilaments inside the nuclear pore complex core.

• Mahmoud Shaaban Mohamed
• Masaharu Hazawa
• Akiko Kobayashi
• Laurent Guillaud
• Takahiro Watanabe-Nakayama
• Mizuho Nakayama
• Hanbo Wang
• Noriyuki Kodera
• Masanobu Oshima
• Toshio Ando
• Richard W Wong

抄録

核細孔複合体（NPC）は、フェニルアラニン-グリシン（FG）モチーフ（FG-NUPs）を持つ非構造化領域（IDR）を内在するNUPを中心に構成される中心選択的バリアを持つゲーティングナノマシンである。NPCの中心的なFGネットワークのダイナミクスは、FG-NUPsの液-液相分離(LLPS)が構造解析から遠ざかっているため、あまり理解されていない。さらに、中心ルーメンに存在する単一FG-NUP-バイオフィラメントの働くメカニズムは不明である。一般的に、柔軟性のあるバイオフィラメントは、その運動や相互作用の間に絡み合ったり、結びついたりすると考えられている。しかし、ナノスケールでのフィラメントの結び目の可視化はまだ行われていない。本研究では、高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)を用いて、ナノスケールの分解能でFG-NUPの構造を時空間的に追跡し、大腸直腸細胞やオルガノイドのNPCにおけるFG-NUPの構造を約150msの時間スケールで明らかにする方法を報告する。その結果、FG-NUPの単一フィラメントを追跡したところ、正常モデルと癌モデルでは、単一フィラメントの太さが不均一であり、これがフィラメントの回転と運動に影響を与えていることが明らかになった。特に、FG-NUPは様々な癌で過剰発現していることが明らかになった。私たちは、FG-NUP 阻害剤であるトランス-1,2-シクロヘキサンジオールを用いて、侵攻性大腸癌細胞やオルガノイドにおいて、中心プラグのサイズが有意に減少し、フィラメント構造に戻ることを発見しました。これらのデータは、FG-NUPs の可逆的な自己組織化が中心プラグの部分的な生合成に発展するモデルを示していた。合わせて、HS-AFMは、数十年にわたって回避されたままであったネイティブFG-NUPsの単一フィラメントの追跡と操作を可能にした。

Nuclear pore complex (NPC) is a gating nanomachine with a central selective barrier composed mainly of Nups, which contain intrinsically disordered (non-structured) regions (IDRs) with phenylalanine-glycine (FG) motifs (FG-NUPs). The NPC central FG network dynamics is poorly understood, as FG-NUPs liquid-liquid phase separation (LLPS) have evaded structural characterization. Moreover, the working mechanism of single FG-NUP-biofilaments residing at the central lumen is unknown. In general, flexible biofilaments are expected to be tangled and knotted during their motion and interaction. However, filament knotting visualization in real-time and space has yet to be visualized at the nanoscale. Here, we report a spatiotemporally tracking method for FG-NUP organization with nanoscale resolution, unveiling FG-NUP conformation in NPCs of colorectal cells and organoids at timescales of ~150 ms using high-speed atomic force microscopy (HS-AFM). Tracking of FG-NUP single filaments revealed that single filaments have a heterogeneous thickness in normal and cancer models which in turn affected the filament rotation and motion. Notably, FG-NUPs are overexpressed in various cancers. Using the FG-NUP inhibitor, trans-1,2-cyclohexanediol, we found that central plug size was significantly reduced and incompletely reversible back to filamentous structures in aggressive colon cancer cells and organoids. These data showed a model of FG-NUPs reversible self-assembly devolving into the central plug partial biogenesis. Taken together, HS-AFM enabled the tracking and manipulation of single filaments of native FG-NUPs which has remained evasive for decades.

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