タンパク質分解産物を捕捉するためのアフィニティー試薬としてカスパーゼ7を工学する

Engineering caspase 7 as an affinity reagent to capture proteolytic products.

• Amir S Razai
• Scott J Snipas
• Marcin Poreba
• Domenico Fasci
• Guy S Salvesen

抄録

多くのプロテアーゼが高い特異性で基質を認識することから、プロテアーゼの基質結合裂を足場にしてアフィニティー試薬を作製することが理論的には可能であると考えられる。本研究では、カスパーゼ 7 を足場として、プロテアーゼ分解の基質と生成物を区別するための試薬の開発を目指した。まず、触媒を使わずに基質結合型への変換が可能なカスパーゼ７の形態を設計した。生成物のみのトラップを生成することを求めて、我々はさらに、新たに生成された生成物のネオC末端に負の電荷の生成を補償する変異を組み込むことによって、この構造を設計した。これは、基質結合クレフト内のわずか3つの置換で達成された。さらに、ペプチドに対する生成物トラップの親和性は、親の基質に対するカスパーゼ７の親和性と同等であった。最後に、プロダクトトラップとのハイブリッド蛍光タンパク質の生成は、アポトーシス細胞を特異的に認識する試薬を提供し、様々なシステインおよびセリンプロテアーゼのための親和性とイメージング剤を開発するためのこのようなアプローチの汎用性を強調しています。

Many proteases recognize their substrates with high specificities, with this in mind, it should theoretically be possible to utilize the substrate binding cleft of a protease as a scaffold to engineer an affinity reagent. In this study, we sought to develop reagents that would differentiate between substrates and products of proteolysis, based on a caspase 7 scaffold. Firstly, we engineered a form of caspase 7 that can undergo conversion to a substrate binding conformation without catalysis. Seeking to generate a product-only trap, we further engineered this construct by incorporating mutations that compensate for the generation of a negative charge in the neo C terminus of a newly generated product. This was accomplished with only three substitutions within the substrate binding cleft. Moreover, the affinity of the product trap for peptides was comparable to the affinity of caspase 7 to parental substrates. Finally, generation of a hybrid fluorescent protein with the product trap provided a reagent that specifically recognized apoptotic cells and highlights the versatility of such an approach in developing affinity and imaging agents for a variety of cysteine and serine proteases.

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