鳥類病原性大腸菌における抗生物質感受性制御におけるLsrRの役割

Role of LsrR in the regulation of antibiotic sensitivity in avian pathogenic Escherichia coli.

• Lumin Yu
• Wenchang Li
• Qian Li
• Xiaolin Chen
• Jingtian Ni
• Fei Shang
• Ting Xue

抄録

鳥類病原性大腸菌（APEC）は、ニワトリ、アヒル、ハト、七面鳥などの鳥類において様々な腸管外疾患を引き起こす特定の腸管外病原性大腸菌群である。これらの疾患は、世界の養鶏業界に大きな経済的損失をもたらしています。しかし、感染症の治療に抗生物質が過剰に使用されたことにより、細菌が抗生物質に耐性を持つようになってきた。多剤排出ポンプの開発は、細菌の抗生物質耐性化の重要なメカニズムの一つである。多剤排出ポンプであるMdtHは、トランスポーターの主要ファシリテーター・スーパーファミリーに属し、ノルフロキサシンやエノキサシンなどのキノロン系抗生物質に対する耐性をもたらします。LsrRは、移動性、バイオフィルム形成、抗生物質感受性など、無数の生物学的プロセスに関与する数百の遺伝子を制御している。しかし、LsrRがmdtHの転写を制御し、それがAPECにおける様々な抗生物質に対する細菌の耐性に影響を与えるかどうかは報告されていない。本研究では、親株APECX40（WT）からlsrR変異株を構築し、ハイスループットシーケンシングを行い、WT株と変異株XY10の転写プロファイルを解析した。その結果、lsrR遺伝子を欠失させるとmdtH転写レベルが上昇することがわかった。さらに、lsrR過剰発現株とmdtH過剰発現株を構築し、抗菌感受性試験、抗菌活性アッセイ、リアルタイム逆転写PCR、電気泳動移動度シフトアッセイを行い、mdtH多剤排出ポンプにおけるLsrRの分子制御機構を検討した。その結果，lsrR変異株とmdtH過剰発現株は，mdtHの転写レベルを上昇させることにより，ノルフロキサシン，オブロキサシン，シプロフロキサシン，テトラサイクリンに対する感受性を低下させることが明らかになった．さらに，lsrR過剰発現株は，mdtH転写産物レベルを低下させることにより，ノルフロキサシン，オブロキサシン，シプロフロキサシン，テトラサイクリンに対する細胞感受性を増加させた．その結果、LsrRはmdtHプロモーターに直接結合していることが明らかになった。したがって、本研究は、LsrRがmdtHのプロモーター領域に直接結合することで、mdtHの転写を阻害することを初めて実証したものである。この作用は、その後、APECX40における前述の4種類の抗生物質に対する感受性を増加させる。

Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is a specific group of extraintestinal pathogenic E. coli that causes a variety of extraintestinal diseases in chickens, ducks, pigeons, turkeys, and other avian species. These diseases lead to significant economic losses in the poultry industry worldwide. However, owing to excessive use of antibiotics in the treatment of infectious diseases, bacteria have developed antibiotic resistance. The development of multidrug efflux pumps is one important bacterial antibiotic resistance mechanism. A multidrug efflux pump, MdtH, which belongs to the major facilitator superfamily of transporters, confers resistance to quinolone antibiotics such as norfloxacin and enoxacin. LsrR regulates hundreds of genes that participate in myriad biological processes, including mobility, biofilm formation, and antibiotic susceptibility. However, whether LsrR regulates mdtH transcription and then affects bacterial resistance to various antibiotics in APEC has not been reported. In the present study, the lsrR mutant was constructed from its parent strain APECX40 (WT), and high-throughput sequencing was performed to analyze the transcriptional profile of the WT and mutant XY10 strains. The results showed that lsrR gene deletion upregulated the mdtH transcript level. Furthermore, we also constructed the lsrR- and mdtH-overexpressing strains and performed antimicrobial susceptibility testing, antibacterial activity assays, real-time reverse transcription PCR, and electrophoretic mobility shift assays to investigate the molecular regulatory mechanism of LsrR on the MdtH multidrug efflux pump. The lsrR mutation and the mdtH-overexpressing strain decreased cell susceptibility to norfloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin, and tetracycline by upregulating mdtH transcript levels. In addition, the lsrR-overexpressing strain increased cell susceptibility to norfloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin, and tetracycline by downregulating mdtH transcript levels. Electrophoretic mobility shift assays indicated that LsrR directly binds to the mdtH promoter. Therefore, this study is the first to demonstrate that LsrR inhibits mdtH transcription by directly binding to its promoter region. This action subsequently increases susceptibility to the aforementioned four antibiotics in APECX40.

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