あした葉セスキテルペン合成酵素遺伝子のcDNAクローニングと機能解析

cDNA Cloning and Functional Analyses of Ashitaba (Angelica keiskei) Sesquiterpene Synthase Genes.

• Kurin Iimura
• Jun-Ichiro Hattan
• Norihiko Misawa
• Kazutoshi Shindo

抄録

アンジェリカ・ケイケイ（灰田葉）は、アヤメ科に属する食用植物である。我々は、ヒト（具体的には日本人）が食べている葉に含まれるセスキテルペンに着目し、GC-MSで数種のセスキテルペンの存在を確認した。そこで、アシタバの葉からtotal RNAを抽出し、逆転写した後、得られたcDNAを用いて退化PCRを行い、cDNA末端を迅速に増幅した。その結果、2つの完全長Tps遺伝子（AkTps1、AkTps2と命名）を単離することができた。この 2 つの遺伝子の機能解析を、セスキテルペン合成酵素の基質（ファルネシル二リン酸）量を増やすためにメバロネート経路遺伝子を発現させた大腸菌を用いて行ったところ、AkTps1 はゲルマクレーン D 合成酵素を、AkTps2 はゲルマクレーン B と少量のゲルマクレーン D の生成を触媒する酵素（ゲルマクレーン B, D 合成酵素）をコードしていることが明らかになった。これら2つのセスキテルペンのファルネシル二リン酸（FPP）からファルネシルカチオンを介した生合成経路を提案した。

Angelica keiskei (ashitaba) is an edible plant belonging to the Apiacea family. We focused on sesquiterpenes in the leaves eaten by humans (specifically, in the Japanese population), and confirmed the presence of several sesquiterpenes by GC-MS. Thus, total RNA was extracted from the ashitaba leaves, reverse transcribed, and the resultant cDNAs were used for degenerate PCR followed by rapid amplification of cDNA ends. Consequently, we were able to isolate two full-length Tps genes (designated AkTps1 and AkTps2). Functional analysis of these two genes was carried out with Escherichia coli cells that expressed mevalonate pathway genes to increase the substrate (farnesyl diphosphate) amount of sesquiterpene synthase, revealing that AkTps1 encodes germacrene D synthase, and AkTps2 codes for an enzyme that catalyzes the generation of germacrene B and smaller amounts of germacrene D (a germacrene B and D synthase). We proposed biosynthetic routes of these two sesquiterpenes from farnesyl diphosphate (FPP) via farnesyl cation.