CRISPRを標的とした塩基編集削除を用いたアセト原性細菌のリプログラミング

Reprogramming Acetogenic Bacteria with CRISPR-Targeted Base Editing Deamination.

• Peng-Fei Xia
• Isabella Casini
• Sarah Schulz
• Christian-Marco Klask
• Largus T Angenent
• Bastian Molitor

抄録

アセト原性細菌は、無機一炭素（C1）ガスを有機化学物質に変換する能力を持つことから、バイオテクノロジーの筐体微生物として人気が高まっている。酢酸菌の可能性を十分に引き出すためには、設計された機能を設計したり、生理機能を調べたりするための合成生物学的なツールが必要不可欠である。本研究では、CRISPRを標的とした脱アミノ化に基づくアセト原性細菌のための1ヌクレオチド分解能でのゲノム編集ツール、すなわち塩基編集を報告する。このツールは、ヌクレアーゼで不活性化されたCas9と活性化誘導性シチジンデアミナーゼを組み合わせ、従来のCRISPR-Casシステムを細菌に適用する際に一般的にボトルネックとなっていたDNA切断、ホモロジー誘導修復、ドナーDNAなしでシトシンからチミンへの置換を可能にする。本研究では、モデルとなるアセト原性細菌を用いて、モジュール化された塩基編集ツールの設計と検証を行った。また、その編集原理を検討した結果、ゲノム全体での塩基編集が可能であることと、オフターゲットイベントの可能性を明らかにしました。さらに、アセテート生産とエタノール生産に関連する遺伝子を、アセテート生産の改善に向けて炭素流束を再プログラムするために、時期尚早のSTOPコドンを設置することで、個別に破壊した。この結果、目的とする表現型を持ち、安定した遺伝子型を持つ遺伝子組換え株が得られた。私たちのベース編集ツールは、アセト原性細菌の応用と研究を促進し、細菌全般のCRISPR-Casベースのゲノム編集をアップグレードするための青写真を提供しています。

Acetogenic bacteria are rising in popularity as chassis microbes for biotechnology due to their capability of converting inorganic one-carbon (C1) gases to organic chemicals. To fully uncover the potential of acetogenic bacteria, synthetic biology tools are imperative to either engineer designed functions or to interrogate the physiology. Here, we report a genome-editing tool at a one-nucleotide resolution, namely base editing, for acetogenic bacteria based on CRISPR-targeted deamination. This tool combines nuclease deactivated Cas9 with activation-induced cytidine deaminase to enable cytosine-to-thymine substitution without DNA cleavage, homology-directed repair, and donor DNA, which are generally the bottlenecks for applying conventional CRISPR-Cas systems in bacteria. We designed and validated a modularized base-editing tool in the model acetogenic bacterium . The editing principles were investigated, and an analysis revealed the capability of base editing across the genome and the potential for off-target events. Moreover, genes related to acetate and ethanol production were disrupted individually by installing premature STOP codons to reprogram carbon flux toward improved acetate production. This resulted in engineered strains with the desired phenotypes and stable genotypes. Our base-editing tool promotes the application and research in acetogenic bacteria and provides a blueprint to upgrade CRISPR-Cas-based genome editing in bacteria in general.