アゾスピリラのリポ多糖の形成と運動性に影響を与える膜タンパク質のプラスミド遺伝子

Plasmid gene for putative integral membrane protein affects formation of lipopolysaccharide and motility in Azospirillum brasilense Sp245.

• Lilia P Petrova
• Stella S Yevstigneyeva
• Yulia A Filip'echeva
• Andrei V Shelud'ko
• Gennady L Burygin
• Elena I Katsy

抄録

細菌 Azospirillum brasilense は北極および側面のべん毛の仕事のために泳ぎ、群がることができます。その主要な表面糖鎖ポリマーは、リポ多糖類（LPS）とCalcofluor結合多糖類（Cal表現型）で構成されています。運動性および表面のグリコポリマーは植物が付いている植物関連細菌の相互作用のために重要です。切子状植物性内生菌A. brasilense Sp245は、同一のO多糖類を含む2つの抗原的に異なるLPS、LpsIおよびLpsIIを産生する。以前に、ベクター pJFF350 を用いてランダムな Omegon-Km 変異誘発を行い、麻痺しているが鞭毛を保持している Sp245 の変異体 KM018 を構築した。この突然変異体は、カルコフルオロ結合多糖類とLpsIIを産生することができなくなった。アゾスピリラにおける表面糖質生産と鞭毛運動の遺伝的側面に関する実験データは限られているため、本研究の目的は、突然変異体で不活化された株Sp245のコーディング配列を同定し、より詳細に調べることであった。その結果、pJFF350 は Sp245 の 6 番目のプラスミドにある機能未知の膜タンパク質（AZOBR_p60025）のコード化配列に組み込まれていることがわかった。この機能未知膜タンパク質の役割を明らかにするために、AZOBR_p60025を発現ベクターpRK415にクローニングし、変異体KM018の遺伝子相補に使用した。SDS-PAGE、免疫二分化および線形免疫電気泳動解析の結果、KM018株（pRK415-p60025）では、野生型のLpsI LpsIIプロファイルが回復していた。相補変異体はCal表現型を有し、遊泳および群集運動が可能であった。このように、AZOBR_p60025がコードするタンパク質は、主要な細胞表面糖鎖ポリマーの組成、およびアゾスピリラの単細胞運動性と社会運動性に有意に影響を与えていることがわかった。

The bacterium Azospirillum brasilense can swim and swarm owing to the work of polar and lateral flagella. Its major surface glycopolymers consist of lipopolysaccharides (LPS) and Calcofluor-binding polysaccharides (Cal phenotype). Motility and surface glycopolymers are important for the interactions of plant-associated bacteria with plants. The facultative plant endophyte A. brasilense Sp245 produces two antigenically different LPS, LpsI, and LpsII, containing identical O-polysaccharides. Previously, using vector pJFF350 for random Omegon-Km mutagenesis, we constructed a mutant of Sp245 named KM018 that still possessed flagella, although paralyzed. The mutant was no longer able to produce Calcofluor-binding polysaccharides and LpsII. Because of the limited experimental data on the genetic aspects of surface glycopolymer production and flagellar motility in azospirilla, the aim of this study was to identify and examine in more detail the coding sequence of strain Sp245, inactivated in the mutant. We found that pJFF350 was integrated into a coding sequence for a putative integral membrane protein of unknown function (AZOBR_p60025) located in the sixth plasmid of Sp245. To clarify the role of the putative protein, we cloned AZOBR_p60025 in the expression vector pRK415 and used it for the genetic complementation of mutant KM018. The SDS-PAGE, immunodiffusion, and linear immunoelectrophoresis analyses showed that in strain KM018 (pRK415-p60025), the wild-type LpsI LpsII profile was restored. The complemented mutant had a Cal phenotype and it was capable of swimming and swarming motility. Thus, the AZOBR_p60025-encoded protein significantly affects the composition of the major cell-surface glycopolymers and the single-cell and social motility of azospirilla.