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ミトコンドリアターゲティング農薬のパネルを用いたHepG2およびRPTEC/TERT1細胞におけるミトコンドリア呼吸抑制のマルチパラメトリック評価
Multiparametric assessment of mitochondrial respiratory inhibition in HepG2 and RPTEC/TERT1 cells using a panel of mitochondrial targeting agrochemicals.
PMID: 32607615 DOI: 10.1007/s00204-020-02792-5.
抄録
代謝性疾患、老化の加速、神経変性疾患、特定の有害物質による臓器毒性など、いくつかの病態においてミトコンドリア機能障害が中心的な役割を果たしているという証拠が出てきています。ミトコンドリアの機能障害を評価することは容易なことではなく、そのような研究の結果は使用する細胞の種類やアッセイ法に依存します。ここでは、電子輸送鎖（ETC）阻害剤のミトコンドリア関連パラメータへの影響を、HepG2とRPTEC/TERT1の2つのヒト細胞型で系統的に調査した。細胞は、NADH 脱水素酵素（複合体 I、CI）、コハク酸脱水素酵素（複合体 II、CII）、チトクロム bc1 複合体（複合体 III、CIII）の阻害剤からなる 20 種類の ETC 阻害農薬とカプサイシンに幅広い濃度で曝露された。生存率アッセイ、乳酸産生、ミトコンドリア膜電位（MMP）、細胞外酸性化率[ECAR]と酸素消費率[OCR]を同時に測定するシーホースバイオアナライザーを含む試験のバッテリーを利用した。CI阻害剤は、両細胞型においてOCRの強力な減少、ミトコンドリア膜電位の低下、ECARの増加、乳酸産生の増加を引き起こした。CI阻害剤への24時間の曝露は、グルコースの存在下でRPTEC/TERT1細胞と3次元スフェロイド培養HepG2細胞の生存率を低下させた。CI阻害剤は、グルコースが存在しない場合にのみ、2次元HepG2の生存率を低下させた。CII阻害剤は、10μMまでの無傷細胞では目立った効果はなかった。CIII阻害剤はCI阻害剤と同様の効果を示した。アンチマイシンAは最も強力なCIII阻害剤であり、ナノモル範囲の活性を有していた。提案されたCIII阻害剤シアゾファミドは、両細胞型においてミトコンドリアのアンカップリングシグナルを示した。本研究は、ミトコンドリア評価ワークフローの包括的な例を示し、ETC阻害の測定可能なキーイベントを確立した。
Evidence is mounting for the central role of mitochondrial dysfunction in several pathologies including metabolic diseases, accelerated ageing, neurodegenerative diseases and in certain xenobiotic-induced organ toxicity. Assessing mitochondrial perturbations is not trivial and the outcomes of such investigations are dependent on the cell types used and assays employed. Here we systematically investigated the effect of electron transport chain (ETC) inhibitors on multiple mitochondrial-related parameters in two human cell types, HepG2 and RPTEC/TERT1. Cells were exposed to a broad range of concentrations of 20 ETC-inhibiting agrochemicals and capsaicin, consisting of inhibitors of NADH dehydrogenase (Complex I, CI), succinate dehydrogenase (Complex II, CII) and cytochrome bc1 complex (Complex III, CIII). A battery of tests was utilised, including viability assays, lactate production, mitochondrial membrane potential (MMP) and the Seahorse bioanalyser, which simultaneously measures extracellular acidification rate [ECAR] and oxygen consumption rate [OCR]. CI inhibitors caused a potent decrease in OCR, decreased mitochondrial membrane potential, increased ECAR and increased lactate production in both cell types. Twenty-fourhour exposure to CI inhibitors decreased viability of RPTEC/TERT1 cells and 3D spheroid-cultured HepG2 cells in the presence of glucose. CI inhibitors decreased 2D HepG2 viability only in the absence of glucose. CII inhibitors had no notable effects in intact cells up to 10 µM. CIII inhibitors had similar effects to the CI inhibitors. Antimycin A was the most potent CIII inhibitor, with activity in the nanomolar range. The proposed CIII inhibitor cyazofamid demonstrated a mitochondrial uncoupling signal in both cell types. The study presents a comprehensive example of a mitochondrial assessment workflow and establishes measurable key events of ETC inhibition.