哺乳類細胞の小胞体中でのマルチドメインタンパク質LDL受容体の非ベクター的でありながら共翻訳的な折り畳みを観察した

Observing the nonvectorial yet cotranslational folding of a multidomain protein, LDL receptor, in the ER of mammalian cells.

• Hiroshi Kadokura
• Yui Dazai
• Yo Fukuda
• Naoya Hirai
• Orie Nakamura
• Kenji Inaba

抄録

タンパク質は、単一のポリペプチド内に複数の構造単位を組み込んで進化してきました。その結果、マルチドメインタンパク質は全プロテオームの大部分を占めています。マルチドメインタンパク質のドメインは、各ドメインがリボソームやタンパク質トランスロケーションチャネルから出てくる際に、それぞれのドメインが個別に、そしてベクター的に元の構造に折り畳まれることが多く、ドメイン間のミスフォールディングのリスクを低減させています。しかし、マルチドメインタンパク質の中には、非ネイティブなジスルフィド結合を持つ中間体を介して、小胞体（ER）内で非ベクター的に折り畳まれるものもあり、これらは合成後にゆっくりとネイティブな構造にシャッフルされると考えられていた。しかし、どのようにして非ベクター的に折り畳むのか、そのメカニズムは明らかになっていない。本研究では、LDL受容体（LDLR）の最N末端領域において、非ネイティブなジスルフィド結合からネイティブなジスルフィド結合へのシャッフルが、合成中の特定のタイミングで始まっていることを、二次元（二次元）ゲル電気泳動と正しく折り畳まれたドメインを認識するコンフォメーション特異的抗体を用いて明らかにした。その結果、LDLRの上流ドメインのジスルフィド結合のシャッフリングを助ける領域が同定され、その結果、LDLRの共翻訳フォールディングが促進されることが明らかになった。このように、血漿膜結合型マルチドメインタンパク質は、上流ドメインの非ベクター性フォールディングを促進する配列を進化させた。これらの知見は、哺乳類細胞の小胞体におけるマルチドメインタンパク質の非ベクター性フォールディングが、これまで考えられていた以上に協調的かつ精巧に行われていることを示している。このことは、マルチドメインタンパク質が生きた細胞の小胞体中でどのように非ベクター的に折り畳まれているのかという、これまでの見方を覆すものである。

Proteins have evolved by incorporating several structural units within a single polypeptide. As a result, multidomain proteins constitute a large fraction of all proteomes. Their domains often fold to their native structures individually and vectorially as each domain emerges from the ribosome or the protein translocation channel, leading to the decreased risk of interdomain misfolding. However, some multidomain proteins fold in the endoplasmic reticulum (ER) nonvectorially via intermediates with nonnative disulfide bonds, which were believed to be shuffled to native ones slowly after synthesis. Yet, the mechanism by which they fold nonvectorially remains unclear. Using two-dimensional (2D) gel electrophoresis and a conformation-specific antibody that recognizes a correctly folded domain, we show here that shuffling of nonnative disulfide bonds to native ones in the most N-terminal region of LDL receptor (LDLR) started at a specific timing during synthesis. Deletion analysis identified a region on LDLR that assisted with disulfide shuffling in the upstream domain, thereby promoting its cotranslational folding. Thus, a plasma membrane-bound multidomain protein has evolved a sequence that promotes the nonvectorial folding of its upstream domains. These findings demonstrate that nonvectorial folding of a multidomain protein in the ER of mammalian cells is more coordinated and elaborated than previously thought. Thus, our findings alter our current view of how a multidomain protein folds nonvectorially in the ER of living cells.